АРВТ — антиретровирусная терапия

ВИЧ — вирус иммунодефицита человека

СПИД — синдром приобретенного иммунодефицита

HCV — вирус гепатита С

I-FABP — кишечный протеин, связывающий жирные кислоты

Резюме

Хроническая активация иммунной системы при инфекции, вызванной вирусом иммунодефицита (ВИЧ), в настоящее время рассматривается как основной фактор, определяющий снижение численности T-лимфоцитов CD4⁺ и развития синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИД) [1, 2]. Ее причины связывают с реакцией иммунных клеток на вирус [2], гомеостатической пролиферацией [3], микробной транслокацией из кишечника [4], нарушением баланса субпопуляций T-клеток CD4⁺ [2]. Антиретровирусная терапия (АРВТ) приводит к снижению уровня иммунной активации, но не способна вызвать ее полное подавление [5]. Кроме того, известно, что причины активации T-лимфоцитов CD4⁺ и CD8⁺ могут различаться [6]. Изложенное определяет сложность интерпретации данных, полученных при обследовании ВИЧ-инфицированных пациентов. Еще большие затруднения возникают при коинфекциях, среди которых доминирующее положение занимает коинфицирование вирусом гепатита С (HCV). В России высокий уровень ВИЧ/HCV-коинфекции связан с неконтролируемым употреблением инъекционных наркотиков [7]. Ее доля среди ВИЧ-инфицированных наркопотребителей может достигать 93% [8]. Для ВИЧ/HCV-коинфицированных пациентов также характерна иммунная активация [9]. Ввиду важной роли данного синдрома и широкого распространения заболевания оценка возможных причин активации иммунной системы при ВИЧ/HCV-коинфекции становится актуальной задачей.

План работы одобрен этическим комитетом (рег. №IRB00010009) Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН. Участники исследования (62 человека), давшие письменное информированное согласие, разделены на 3 группы: 1-я — ВИЧ-инфицированные пациенты, коинфицированные HCV (ВИЧ+HCV+); 2-я — ВИЧ-моноинфицированные субъекты (ВИЧ+HCV–); 3-я — неинфицированные условно здоровые добровольцы (ВИЧ–HCV–). У всех обследованных в крови отсутствовал антиген HBs, а во 2-й и 3-й группах — антитела к HCV. Пациенты с ВИЧ-инфекцией к моменту обследования не менее 2 лет получали АРВТ. Схема терапии включала 2 нуклеозидных ингибитора обратной транскриптазы в комбинации либо с ингибитором протеазы, бустированным ритонавиром, либо с ненуклеозидным ингибитором обратной транскриптазы. Лечение интерферонами коинфицированным больным не проводилось.

Образцы крови получали из локтевой вены в количестве 15 мл в пробирки типа «Vacutainer», содержащие ЭДТА. После перемешивания отделяли часть крови для определения ВИЧ и HCV. Мононуклеары крови получали путем центрифугирования в градиенте плотности диаколла («Диа-М»): 1,077. Предварительно кровь разводили в 2 раза средой RPMI-1640 («Sigma»). Наслаивали 2 объема разведенной крови на 1 объем диаколла. Центрифугирование осуществляли при 400 g в течение 40 мин. Выделенные клетки собирали, дважды отмывали средой RPMI-1640, подсчитывали в камере Горяева. Клетки консервировали в инактивированной эмбриональной телячьей сыворотке («Gibco»), содержащей 10% ДМСО («MPBiochemical»), замораживали сначала до температуры –80 °C, а затем переносили в жидкий азот. Перед проведением исследования клетки размораживали.

Численность T-лимфоцитов CD4⁺ и CD8⁺ определяли на проточном цитофлюориметре FACSCalibur («BectonDickinson», США) с использованием набора моноклональных антител «BectonDickinson Immunocytometry Systems (BDIS) Simultest». Активированные T-клетки CD4⁺ и CD8⁺ выявляли по одновременной экспрессии на них маркеров CD38 и HLA-DR, пролиферирующие — по наличию Ki-67.

Концентрации в крови кишечного протеина, связывающего жирные кислоты (intestinalfattyacidbindingprotein — I-FABP) определяли иммуноферментным набором «R&D Systems» (США). Уровни РНК ВИЧ в плазме крови устанавливали с использованием наборов «Versant HIV 1 RNA 3.0 assay b» («Bayer», Германия) на анализаторе Versant 440 amplifier («Siemens», Германия). Наличие HCV и его уровень в крови тестировали методом полимеразной цепной реакции в реальном времени наборами «ОТ Гепатоген C количественный» («ДНК-технология», Россия) на термоциклере iCycler IQ5 («BioRad»).

Статистическая обработка. Полученные данные представлены в виде медиан, межквартильных интервалов и 10—90% размахов. Достоверность различий определяли на основе критерия Манна—Уитни. Сравнение частотных характеристик выполняли с использованием критерия χ² на основе метода четырехпольных таблиц. Корреляционный анализ проводили по Спирмену. Статистические расчеты и построение графиков осуществляли с использованием программы Statistica 6.0.

Группы ВИЧ+HCV+ и ВИЧ+HCV– (см. таблицу) не различались по возрасту, числу T-клеток CD4+ крови до терапии, длительности АРВТ и концентрации ВИЧ в крови (полное подавление репликации). Вместе с тем эти группы различались по половому составу и путям передачи инфекции. Среди коинфицированных пациентов достоверно больше мужчин, а основной путь их заражения — инъекционный, что связано с внутривенным употреблением наркотиков. Большую часть группы ВИЧ-моноинфицированных составили женщины. Почти все они заражены половым путем. Это отразилось и на продолжительности заболевания: в России длительное время главным источником ВИЧ-инфицирования являлись потребители наркотиков. Следует также отметить, что при проведении АРВТ в группе ВИЧ+HCV– восстановление T-клеток CD4⁺ протекало активнее, чем в группе ВИЧ+HCV+.

Доля активированных клеток среди T-лимфоцитов CD4⁺ (рис. 1) в группах зараженных ВИЧ пациентов была одинаковой. Медианы и интерквартильные размахи составили для ВИЧ+HCV+ 7,8% (5,7; 10,7%); для ВИЧ+HCV– 7% (4,5; 12,5%). Но эти показатели статистически значимо выше, чем в контроле (ВИЧ–HCV–): 4,8% (2,8; 5,8%).

Активация CD8⁺ T-лимфоцитов более выражена: ВИЧ+HCV+ — 24,7% (15,5; 31,3%); ВИЧ+HCV- — 14,8% (10,9; 17,1%); ВИЧ–HCV- — 5,7% (3,9; 7,5%). При этом значения в двух группах ВИЧ-инфицированных субъектов не только существенно превышали уровень здоровых людей, но статистически значимо различались между собой. Исходя из того что максимальная активация T-клеток CD8+ наблюдалась у ВИЧ/HCV-коинфицированных пациентов, мы провели корреляционный анализ ее зависимости от концентрации HCV в крови. Однако связь между этими показателями в группе ВИЧ+HCV+ не выявлена (r=0,033; р>0,05).

Реакция T-клеток на вирус может реализоваться как через рецепторы врожденного иммунитета, так и путем распознавания его пептидов в составе молекул главного комплекса гистосовместимости. В последнем случае T-лимфоциты обычно отвечают пролиферацией. Действительно, пролиферативная активность T-клеток CD4⁺ и CD8⁺ в группах зараженных ВИЧ пациентов оказалась повышенной. Медианы и интерквартильные размахи для T-лимфоцитов CD4⁺, экспрессирующих Ki-67, составили: 1-я группа (ВИЧ+HCV+) 1,9% (1,5; 2,7%); 2-я группа (ВИЧ+HCV–) 1,7% (1,4; 1,9%); 3-я группа (ВИЧ–HCV–) 0,8% (0,7; 1,1%); р_1—3<0,001; р_2—3<0,001. Результаты для CD8+ T-клеток: 1-я группа (ВИЧ+HCV+) 1,9% (1,4; 2,3%); 2-я группа (ВИЧ+HCV–) 1,6% (1,3; 2,1%); 3-я группа (ВИЧ–HCV–) 1,1% (0,9; 1,4%); р_1—3<0,001; р_2—3<0,002.

Проверка связи активации T-лимфоцитов CD4+ и CD8+ с процессом их пролиферации при ВИЧ/HCV-коинфекции и ВИЧ-моноинфекции выявила следующее (рис. 2). В группе ВИЧ+HCV+ между уровнями активации и пролиферации + T-клеток как CD4⁺, так и CD8 обнаружены прямые статистически значимые зависимости. Напротив, в группе ВИЧ+HCV– таких связей ни для T-лимфоцитов CD4⁺, ни для CD8⁺ не выявлено. Опираясь на факты, свидетельствующие, что у всех ВИЧ-инфицированных субъектов репликация ВИЧ подавлена под влиянием АРВТ, а у коинфицированных пациентов размножение HCV не ограничено, можно предположить, что активация T-клеток в группе ВИЧ+HCV+ отражает их реакцию на инфицирование HCV.

Причиной активации T-лимфоцитов также может быть микробная транслокация [10], обусловленная нарушением проницаемости кишечника. Деструкцию кишечного эпителия можно оценить по уровню I-FABP в крови. Действительно, концентрации I-FABP в обеих группах ВИЧ-инфицированных пациентов, хотя и не различались между собой, оказались достоверно повышены относительно этого показателя у неинфицированных субъектов (рис. 3, а). Оценка зависимостей активации T-лимфоцитов CD4⁺ и CD8⁺ от нарушения проницаемости кишечника показала (рис. 3, б), что у пациентов группы ВИЧ+HCV– активация T-клеток CD4⁺ и CD8⁺ прямо и статистически значимо связана с уровнем I-FABP в крови. Вместе с тем в группе ВИЧ+HCV+ такая зависимость сохранялась только для T-лимфоцитов CD4⁺. Активация T-клеток CD8⁺ у ВИЧ/HCV-коинфицированных больных не зависела от концентрации I-FABP.

Таким образом, в результате проведенного исследования установлено, что повышенная активация T-лимфо-цитов CD4+ и CD8+ при ВИЧ-моноинфекции связана с деструкцией кишечного эпителия и не зависит от процессов деления клеток. При ВИЧ/HCV-коинфекции активированное состояние T-клеток CD4⁺ определяется как уровнем пролиферативных процессов, так и нарушением кишечного барьера, а T-клеток CD8⁺ — только пролиферацией.

Активация иммунитета у ВИЧ-инфицированных пациентов в значительной мере связана с размером вирусных резервуаров в организме, что можно контролировать по уровню ДНК ВИЧ в клетках крови [11]. Однако данная зависимость обычно проявляется без лечения. Подавление репликации вируса после применения АРВТ приводит к утрате корреляций между содержанием ДНК ВИЧ в крови и активацией (маркеры CD38 и HLA-DR) T-лимфоцитов CD4⁺ и CD8⁺ [12]. Исходя из того что у всех представленных в работе пациентов вирусная нагрузка на фоне терапии меньше 50 копий/мл, мы не рассматриваем влияния ВИЧ на активацию T-клеток. Вместе с тем в хроническую стадию ВИЧ-инфекции существенное влияние на функции иммунокомпетентных клеток оказывает микробная транслокация из кишечника. Она является следствием массовой деструкции T-клеток CD4⁺lamina propria в острую стадию инфекции [13] и слабого (по сравнению с T-лимфоцитами CD4⁺ крови) их восстановления на протяжении всего периода развития заболевания даже на фоне АРВТ [14, 15]. При этом происходит утрата клеток Th17 и Th22, обеспечивающих целостность и нормальное функционирование кишечного эпителия [16]. Попадая через нарушенный барьер в кровоток, бактериальные продукты вызывают активацию клеток врожденного и адаптивного иммунитета [17], что и подтверждено нами результатами корреляционного анализа зависимости уровня активации T-лимфоцитов CD4⁺ и CD8⁺ у ВИЧ-моноинфицированных пациентов от концентрации в крови I-FABP.

Деление лимфоцитов invivo отражает преимущественно два процесса: реакцию на антиген и гомеостатическую пролиферацию — восполнение численности клеток при лимфопении. При этом следует отметить, что в ответ на антиген митотическая активность усиливается в популяции T-клеток как CD4⁺, так и CD8⁺ [3, 18]. Однако гомеостатической пролиферации подвержены главным образом T-лимфоциты CD4⁺ [3]. Эти сведения позволяют, на наш взгляд, объяснить установленные различия в причинах активации T-клеток CD4⁺ и CD8⁺ при ВИЧ-моноинфекции и ВИЧ/HCV-коинфекции. Можно предположить, что в группе ВИЧ+HCV– при подавленной на фоне АРВТ вирусной нагрузке и достаточно эффективном восстановлении численности T-лимфоцитов CD4⁺ основным фактором активации T-клеток CD4⁺ и CD8⁺ служит нарушение кишечного барьера. В то же время терапевтически бесконтрольное размножение HCV в группе ВИЧ+HCV+ и менее интенсивное восстановление у этих пациентов численности T-лимфоцитов CD4⁺ при АРВТ, по-видимому, приводят к запуску пролиферативных реакций T-клеток на антиген и лимфопению. Вместе с тем нами показано, что выраженность деструкции кишечного эпителия в обеих группах ВИЧ-инфицированных пациентов приблизительно одинаковая. Скорее всего, микробная транслокация вносит дополнительный вклад в уровень активации лимфоцитов при ВИЧ/HCV-коинфекции. Однако на фоне выраженной стимуляции антигенами HCV, что в первую очередь приводит к включению эффекторных T-клеток CD8⁺, ее влияние становится второстепенным.

Таким образом, в результате исследования показано, что уровень активации T-лимфоцитов CD8⁺ у больных с ВИЧ/HCV-коинфекцией, находящихся на АРВТ, но не получающих препараты интерферона, выше, чем у ВИЧ-моноинфицированных пациентов, соблюдающих схему назначенного лечения. Основные причины активации T-клеток CD8⁺ в этих группах различны: в 1-й — повышение пролиферации (по-видимому, отражение реакции на антигены вируса гепатита C), во 2-й — нарушение кишечного барьера.

Исследование поддержано Российским научным фондом; грант № 15−15−00016.

Конфликт интересов отсутствует .