ВИФ-1- фактор-1 ингибирующий Wnt

Дкк - белок Диккопф

Дкк-1 - Диккопф-1

МПКТ - минеральная плотность костной ткани

ОБГ - остеобластогенез

ОП - остеопороз

ПТГ - паратиреоидный гормон

СП-Wnt - сигнальный путь Wnt

сФРЗ - белок, связанный с фризельдом

GSK3 - киназа гликогенсинтетазы-3

SOST - склеростин

Sost-dc1 - склеростин, содержащий домен-1

Остеопороз (ОП) - метаболическое заболевание костной ткани, от которого страдают около 200 млн человек по всему миру, в основном женщины в постменопаузе (более 80%) и пожилые мужчины [1]. Развитие О.П., как и многих других хронических заболеваний (атеросклероз и ишемическая болезнь сердца, онкологическая патология, остеоартроз и т. д.), ассоциировано с возрастом.

Вследствие увеличения продолжительности жизни все большая часть населения нуждается в профилактике и лечении ОП [2]. В настоящее время признанным стандартом терапии является применение антирезорбтивных препаратов, таких как бисфосфонаты и деносумаб. Уменьшение разрушения костной ткани в результате применения антирезорбтивной терапии позволяет уменьшить относительный риск переломов примерно на 50% [3]. Из группы анаболических препаратов доступен только один - терипаратид (фрагмент паратгормона 1-34), который применяется в основном для лечения тяжелого ОП со множественными переломами, и длительность его применения ограничена 24 мес [4]. В данных условиях разработка новых анаболических препаратов особенно актуальна. С этой целью проводятся исследования нескольких сигнальных путей, участвующих в ремоделировании кости, одним из которых является СП-Wnt.

СП-Wnt запускает каскад реакций, которые регулируют нормальное эмбриональное развитие, а также участвуют в процессах поддержания клеточного гомеостаза в течение всей жизни организма, затрагивая большинство органов и тканей. Этот древний сигнальный путь развивался еще у первых анаэробных многоклеточных организмов.

Изучение СП-Wnt началось после открытия в 1982 г. протоонкогена Int1 у мышей, известного сейчас как Wnt1. Спустя 5 лет ген wingless идентифицирован по рецессивной мутации, подавляющей у дрозофилы развитие крыльев [5]. Позднее проводилось изучение гомологичного гена Int у позвоночных, что позволило выделить целый класс лигандов, управляющих эмбриологическим развитием животных. С тех пор решающая роль СП-Wnt в эмбриологическом развитии продемонстрирована в различных органах, включая головной и спинной мозг, костную систему и т. д. [6-8]. Кроме того, передача сигналов Wnt имеет большое значение в постнатальном развитии и регенерации тканей в зрелом возрасте [9]

Нарушения функционирования СП-Wnt приводят к ряду генетически обусловленных аномалий развития (отсутствию конечностей [10], нарушению плотности костей, агенезу зубов [11-13]) и заболеваниям, в том числе онкологическим, - раку толстой кишки [14], меланоме [15], карциноме [16] и др. [17].

В качестве цели для терапевтического влияния СП-Wnt предлагает большие возможности. Однако ввиду сложности сигнального каскада Wnt, содержащего лигандов 19 Wnt и более 15 рецепторов и корецепторов, возникают сложности в селективности воздействия. Кроме того, в дополнение к классической канонической индуцированной Wnt-активации катенина, белки Wnt могут вызывать неканонический ответ (т.е. не влияют на уровень β-катенина). Накопление β-катенина также зависит от влияния других клеточных факторов на передачу сигнала Wnt [18].

Таким образом, при разработке новых препаратов необходимо учитывать, что СП-Wnt непосредственно регулирует биологический цикл стволовых клеток и тканевой гомеостаз.

Биология СП-Wnt. Лигандами, или агонистами сигнала Wnt, являются 19 богатых цистеином гликопротеинов - белков Wnt, которые действуют как местные лиганды, локально активирующие сигнальные пути, опосредованные рецепторами, контролируя экспрессию генов, пролиферацию, миграцию и апоптоз клеток. В костной ткани обнаружена экспрессия Wnt 1, Wnt 4 и Wnt 14. Рекомбинантный Wnt 3a способен обеспечить дифференцировку мезенхимальной стволовой клетки по направлению остеобласта, улучшать пролиферацию и выживаемость остеобластов [19]. Wnt 10b способствует подавлению адипогенеза и преимущественной дифференцировке мезенхимальной стволовой клетки по направлению к остеобласту [20]. Потенциально важными для остеобластогенеза (ОБГ) некоторыми исследователями считаются Wnt 1 и Wnt 5a [21, 22]

Лиганды Wnt могут стимулировать несколько сигнальных каскадов, в том числе СП-Wnt (ключевой сигнальный путь для ОБГ), Wnt-кальциевый, протеинкиназа А, и др. [23].

Канонический сигнальный путь отличается накоплением β-катенина в ядре клетки. Неканонический сигнальный путь не влияет на уровень β-катенина, регулирует полярность клетки, метаболизм кальция и др. В каноническом сигнальном пути задействованы Wnt 1, 3а, 8, 10, в то время как в неканоническом - Wnt 4, 5а, 11. Однако некоторые белки Wnt, включая Wnt 1, 5а и 11, стимулируют несколько упомянутых сигнальных путей в зависимости от ситуации и это определяет паракринную регуляцию дифференцировки клетки (например, если доступен тот или иной рецептор) [23, 24]

СП-Wnt играет центральную роль в регулировании обмена костной ткани за счет контроля над синтезом и дифференцировкой мезенхимальных стволовых клеток, стимуляции репликации преостеобластов, индукции ОБГ и подавления апоптоза остеобластов и остеоцитов [25, 26].

Активация сигнала Wnt происходит путем связывания белка Wnt (винглес) с 7-доменным трансмембранным рецептором фризельда (Фзд) и его корецептором - белком 5/6, родственным лиганду липопротеида (LRP5/LRP6) [27]. Активация рецепторного комплекса Wnt приводит к передаче сигнала через комплекс белков (Disheveled, Axin, Flat-1), ингибируя активность киназы гликогенсинтетазы-3 (GSK3) [21]. Данное взаимодействие приводит к стабилизации β-катенина, что способствует его накоплению в цитозоле и транслокации в ядро клетки. В ядре β-катенин активирует факторы транскрипции TCF/LEF (Т-клеточный фактор/лимфоидный фактор, усиливающий процесс связывания внутриядерных компонентов), регулируя экспрессию генов, которые отвечают за ОБГ [28] (см. рисунок).

Антагонисты сигнала Wnt также достаточно специфичны для ОБГ. Так, среди 4 белков Диккопф-1-4 (Дкк-1-4) в костной ткани экспрессируется Дкк-1 [29], определенную роль могут играть Дкк-2 и Дкк-3. Дкк-1 способствует образованию связи между рецептором кремен (krm) и корецептором LRP5, снижая количество доступных рецепторов для взаимодействия, и ОБГ подавляется. Среди 5 секреторных белков, связанных с фризельдом (сФР3−1-5), ОБГ, согласно экспериментальным исследованиям, блокирует сФРЗ-1 [30]. сФРЗ-4 также экспрессируется в мезенхимальных стволовых клетках в зоне костеобразования [31]. Фактор-1 ингибирующий Wnt (ВИФ-1), напрямую взаимодействует с Wnt 3a, Wnt 5a [32]. Таким образом, ВИФ-1 и сФзд-1 нейтрализуют белки винглесс еще до их взаимодействия с Фзд и LRP5/LRP6. Склеростин (SOST) - наиболее специфичен для костной ткани и преимущественно секретируется остеоцитами с максимальным содержанием этого белка в канальцах и лакунах остеоцитов [33, 34]. Склеростин связывается с LRP5, блокируя образование комплекса Wnt-Фзд-LRP5 и тем самым приводя к подавлению костеобразования. Наконец, описан еще один секреторный фактор - склеростин, содержащий домен-1 (Sost-dc1), который относится к классу протеинов Dan/Cerberus и способен блокировать активность Wnt 1, Wnt 3a и Wnt 10b, а также костных морфогенетических протеинов [18, 35, 36] (см. рисунок).

СП-Wnt в развитии наследственных заболеваний скелета. Ключевая роль сигнала Wnt в развитии скелета и ремоделировании костной ткани подчеркивается клинической картиной заболеваний, ассоциированных с генетическими мутациями в генах, кодирующих или регулирующих экспрессию белков этого сигнального пути (табл. 1). В эмбриогенезе СП-Wnt контролирует процесс закладки скелета. Мутация в гене WNT3 приводит к редкому наследуемому по аутосомно-рецессивному типу заболеванию - синдрому тетраамелии, характеризующемуся отсутствием верхних и нижних конечностей. Кроме того, могут встречаться и пороки развития других частей тела: сердца, легких, нервной системы, половых органов, а также деформации лицевого черепа [10]. Генетическая мутация в AXIN2 - ингибиторе СП-Wnt, встречается при наследуемой по аутосомно-доминантному типу семейной форме агенеза зубов, которая характеризуется врожденным отсутствием нескольких зубов [14].

Впервые роль СП-Wnt в обмене костной ткани доказана в 2001 г., когда инактивирующая мутация гена LRP5 была соотнесена с развитием наследуемого по аутосомно-рецессивному типу синдрома остеопороза-псевдоглиомы (характеризуется снижением минеральной плотности костной ткани - МПКТ, предрасположенностью к переломам костей и снижением остроты зрения вследствие отслойки сетчатки и раннего развития катаракты) [12]. Заболевание обусловлено мутацией в гене LRP5, локализующемся в 11-й хромосоме. Вследствие данной мутации LRP5 теряет свои функции, что приводит к снижению костеобразования за счет ингибирования СП-Wnt [12]. Мутации со снижением функции LRP5 могут быть ассоциированы и с развитием ювенильного ОП, обусловленного неадекватным набором пика костной массы в юности [37]. При исследовании на грызунах подтверждено, что инактивация LRP5 приводит к развитию остеопении за счет снижения ОБГ [42].

К противоположному фенотипу приводит точечная мутация G171V в гене LRP5, вследствие которой происходит активация белка LRP5, что вызывает аутосомно-доминантное состояние, известное как феномен повышенной МПКТ [11]. МПКТ у данных пациентов выше, чем в популяции (+5SD), однако качество костной ткани остается хорошим, вследствие чего переломы костей встречаются редко и продолжительность жизни не отличается от среднестатистической [43]. Активирующая мутация LRP5 непосредственно не увеличивает количество Wnt. Вместо этого снижается способность связывания Дкк-1, склеростина - ингибиторов СП-Wnt. Впоследствии выделены и другие мутации LRP5, изменяющие костный обмен [38]. Мутации в LRP6 также отождествлены с изменениями МПКТ у людей. У пациентов с частичной потерей функции LRP6 прослеживалась тенденция к ранней смерти, в том числе связанной с ОП [39]. Кроме того, в экспериментах на мышиной модели мутации LRP6 связаны с нарушением развития костной ткани [44-47].

Несколько десятилетий назад описаны клинические случаи разрастания костной ткани у пациентов из Южной Африки. Данное заболевание, названное склеростозом, наследуется по аутосомно-рецессивному типу и вызвано гомозиготной мутацией в гене SOST, что приводит к недостаточности склеростина [48]. Полное выпадение функции склеростина при склеростозе приводит к преобладанию ОБГ над остеокластогенезом, что проявляется разрастанием костной ткани и высокой МПКТ [40, 49, 50]. Чрезмерное утолщение костей черепа приводит к ущемлению черепных нервов, что клинически выражается лицевым параличом, потерей слуха и обоняния. Следует отметить, что и у гетерозиготных носителей мутации гена SOST МПКТ оказалась выше, чем в популяции [51]. При делеции в регуляторном элементе гена SOST уменьшается количество экспрессируемого склеростина и возникает более мягкая форма заболевания - болезнь ван Бучема [52].

В настоящее время развитие ОП связывают с наследственной предрасположенностью к данному заболеванию, однако весь спектр генов, отвечающих за снижение МПКТ, не выявлен. Полиморфизм генов LRP5, LRP6, GPR177 (Wntless), SFRP1, SOST и RSPO3, входящих в состав СП-Wnt, как показали наблюдения, коррелирует с изменениями МПКТ [53]. Исследования, позволяющие выявить новые данные о влиянии отдельных компонентов Сп-Wnt на регуляцию обмена костной ткани, продолжаются на мышиной модели [54].

Новые целевые молекулы в лечении ОП. Участие СП-Wnt в формировании костной ткани делает его привлекательным для медикаментозного вмешательства в рамках лечения О.П. Существуют две основные концепции воздействия на СП-Wnt: синтез агонистов или блокирование естественных антагонистов. В случае первого подхода добавление рекомбинантных Wnts является дорогостоящей процедурой из-за сложности производства [55], кроме того, белки Wnt могут вызывать неканонический ответ и привести к нежелательным явлениям [56]. Поэтому стратегия ингибирования естественных антагонистов представляется более предпочтительной. Механизмы медикаментозного воздействия на GSK3β, Дкк-1, SFRPs рассмотрены в табл. 2.

Несмотря на высокий терапевтический потенциал регуляции СП-Wnt для коррекции костеобразования, необходимо учитывать возможность канцерогенеза при его избыточной стимуляции. Зарегистрированы мутации β-катенина, APC, Axin, Tcf/Lef1 и Wnt 1, приводящие к онкогенным заболеваниям [64]. Например, мутации APC приводят к развитию колоректального рака [65], а мутации β-катенина связывают с развитием злокачественных заболеваний кроветворной системы [58]. Кроме того, воздействие на СП-Wnt меняет цикл клеток, что может привести к развитию остеосаркомы - злокачественному новообразованию костной ткани, характеризующемуся снижением дифференциации клеток и высокой склонностью к метастазированию [67, 68]. Поэтому необходимо исключать развитие новообразований при разработке принципиально новых анаболических препаратов, вмешивающихся в процесс передачи сигнала Wnt, учитывая длительность их применения.

Склеростин. Относится к антагонистам СП-Wnt, занимая за счет образования связи с LRP5 свободные рецепторы. Склеростин преимущественно секретируется остеоцитами, концентрируясь в канальцах и лакунах клетки. На поверхности остеоцита склеростин связывается с корецептором LRP5 и LRP6 и предотвращает образование комплекса Wnt-Фзд-LRP5, способствуя прерыванию Wnt-сигнализации, замедляя ОБГ и формирование костной ткани [69]. Проследить влияние склеростина на ОБГ возможно при наследственных заболеваниях, связанных с мутацией в гене SOST - склеростоз и болезнь ван Бучема, описанных выше.

Экспрессия склеростина в остеоцитах регулируется гормонами, влияющими на метаболизм костной ткани: паратиреоидным гормоном (ПТГ), кальцитонином и глюкокортикоидами [70]. В исследованиях invitro и на животных показано ингибирующее влияние ПТГ на экспрессию склеростина в остеоцитах [71]. У пациентов с первичным гиперпаратиреозом вследствие длительного повышения уровня ПТГ уровень склеростина ниже, чем после паратиреоидэктомии при нормальном уровне ПТГ, что доказывает отрицательное воздействие ПТГ на экспрессию склеростина. Кальцитонин, наоборот, увеличивает экспрессию склеростина [70, 72, 73].

При исследовании уровня склеростина у женщин в разных возрастных группах доказано, что его уровень в сыворотке крови обратно пропорционален уровню эстрогенов, и достоверно высок у женщин в постменопаузе [74]. Терапия эстрогенами у женщин в постменопаузе с высоким уровнем склеростина способствует его снижению [75].

Зависимость между уровнем склеростина и МПКТ, внеклеточный характер действия и почти исключительная секреция в остеоцитах способствовали рассмотрению склеростина в качестве целевой молекулы для лечения О.П. Кроме того, при наблюдении за пациентами, имеющими гетерозиготную инактивирующую мутацию в гене SOST, отмечено увеличение МПКТ без костных разрастаний, характерных для гомозиготной мутации при склеростозе [51, 76]. Данный вывод позволил предположить, что фармакологическое влияние на уровень склеростина не приведет к разрастанию костной ткани.

В 2009 г. эффективность препарата, содержащего антитела к склеростину, доказана на грызунах со сниженным уровнем эстрогенов в сочетании с остеопенией. Двухнедельное введение 25 мг/кг моноклонального антитела к склеростину мышам способствовало восстановлению МПКТ через 5 нед наблюдения, причем прирост отмечен как кортикальной, так и трабекулярной костной ткани, подтвержденный гистоморфометрическим анализом. Кроме непосредственного увеличения МПКТ отмечено улучшение микроархитектоники кости, что также влияет на прочность скелета. Аналогично на мышиной модели продемонстрировано более быстрое образование костной мозоли при переломах и соответственно заживление [77]. Предварительное лечение алендронатом или золендроновой кислотой не влияло на эффективность антител к склеростину [78, 79]. Не выявлено и половых различий по эффективности антител к склеростину при лечение самок и самцов мышей [80]. Исследования на приматах подтвердили данные результаты [81]. В данных исследованиях антителоопосредованное ингибирование уровня склеростина достоверно приводило к увеличению остеогенеза, скорость которого возвращалась к исходной после выведения антитела из организма [82].

В клинических исследованиях у женщин в постменопаузе участвовали 2 препарата, основанных на структурно отличных друг от друга антителах к склеростину: ромосозумаб и блосозумаб, показавшие хороший клинический эффект.

Ромосозумаб прошел I и II фазы клинических исследований, продемонстрировав хороший профиль безопасности. В I фазе препарат вводился внутривенно или подкожно мужчинам и женщинам в постменопаузе с низкой МПКТ, при этом побочные эффекты были соотносимы с таковыми у плацебо (при подкожном введении 60% по сравнению с 64% для плацебо, при внутривенном введении 25% против 50% для плацебо) и включали местные реакции в месте инъекции, боли в спине, головную боль, головокружение, боли в суставах и констипацию [83].

Во II фазе клинических исследований по оценке эффективности и безопасности применения препарата участвовали 400 женщинах в постменопаузе (длительность наблюдения 12 мес) [84]. В группу наблюдения включались женщины 55-85 лет с постменопаузальным ОП - DEXAT-критерий в поясничных позвонках или шейки бедренной кости от –3,5 до –2. В группе сравнения участницы получали лечение плацебо, алендронатом или терипаратидом. Ромосозумаб в дозе 210 мг ежемесячно способствовал приросту МПКТ во всех участках скелета - на 11,3% в позвоночнике, на 4,1% в бедренной кости и 3,7% в ее шейке. Увеличение маркеров костеобразования наблюдалось с 1-й недели лечения, достигая максимума через 1 мес, снижение их уровня до исходного или ниже происходило в промежутке между 2-м и 10-м месяцем. Маркер резорбции кости С-концевой телопептид коллагена I типа в сыворотке крови значительно снизился в течение 1-й недели и оставался низким в течение 12 мес лечения [48]. Кроме того, оценено влияние ромозосумаба на микроархитектонику костной ткани с помощью компьютерной томографии в Th_XII и L_I. За 12 мес лечения ромозосумабом улучшились кортикальные параметры, такие как кортикальная МПКТ и минеральный состав кортикального слоя кости, по сравнению с таковыми в группе пациентов, получающих терипаратид или плацебо. При этом изменения трабекулярной МПКТ не различались в группах терипаратида и ромозосумаба. С точки зрения безопасности применения частота тяжелых побочных эффектов сопоставима с таковой в группе плацебо, причем их частота в группе, получавшей ромосозумаб в максимальной дозе, составила 14% против 10% в группе плацебо.

В настоящее время препарат находится в III фазе клинических исследований, где клинический эффект ромозосумаба на снижение риска переломов костей оценивается в рамках плацебо-контролируемого исследования у женщин с постменопаузальным ОП.

Другим препаратом, содержащим антитела к склеростину, является блосозумаб. В I фазе рандомизированного плацебо-контролируемого исследования с увеличением дозы препарата в течение 8 нед оценивались безопасность и эффективность препарата [85].

Образование антител к препарату наблюдалось у 12% пациентов, получавших блосозумаб однократно, и в 36% случаев после приема нескольких доз. При этом нейтрализующего влияния антител или увеличения побочных эффектов не отмечено.

Во II фазе проводилось рандомизированное двойное слепое плацебо-контролируемое исследование по оценке безопасности и эффективности применения различных доз препарата, вводимого подкожно, женщинам со средним возрастом 65 лет и постменопаузальным ОП с Т-критерием в поясничных позвонках –2,8, продолжительностью лечения 12 мес. При максимально вводимой дозе блосозумаба 270 мг каждые 2 нед отмечен прирост МПКТ на 17,7% в поясничных позвонках и 6,2% в бедренной кости в целом. Отмечалось преходящее увеличение уровня маркеров костеобразования, тогда как СТХ постепенно снижался на протяжении лечения блосозумабом. Побочные явления на фоне приема препарата включали умеренные реакции в месте инъекции, причем их частота была выше в группе блосозумаба по сравнению с плацебо (22,6-40% против 10,3% в группе плацебо) [86].

В исследованиях обоих препаратов антител к склеростину повышение маркеров костеобразования было кратким и их уровень возвращался к исходному, несмотря на продолжение лечения, а маркеры резорбции кости, напротив, были снижены на фоне лечения. Данная модель изменения маркеров ремоделирования кости является отличной от других препаратов для лечения О.П. Антирезорбтивные препараты - бисфосфонаты и деносумаб, подавляют и резорбцию кости, и костеобразование, а терипаратид повышает маркеры образования кости и через некоторое время и маркеры резорбции кости. Супрессивное действие антител к склеростину на маркеры резорбции кости может быть обусловлен снижением RANKL и увеличением остеопротегерина [87]. Ввиду отличного от имеющихся антиостеопоротических препаратов влияния на ремоделирование кости открытым остается вопрос устойчивости анаболического эффекта после длительного применения (более 1 года) антител к склеростину, а также оптимальной продолжительности лечения [88].

Таким образом, моноклональные антитела к склеростину оказывают уникальное анаболическое воздействие на костную ткань, обусловливая быстрое увеличение МПКТ, и являются перспективным при лечении ОП, однако опубликованных результатов о влиянии антител к склеростину на снижение риска переломов пока нет. Вместе с тем именно эти препараты, наиболее вероятно увеличивают дифференцировку мезенхимальной стволовой клетки по направлению к остеобласту и, возможно, являются первыми препаратами, действующими именно на этапе дифференцировки мезенхимальной стволовой клетки у взрослого человека.

Изучение влияния СП-Wnt на ремоделирование костной ткани позволило выделить новые целевые молекулы для терапевтического вмешательства в процесс остеогенеза. Вместе с тем открытым остается вопрос выявления специфичных для дифференцировки различных тканей агонистов и антагонистов СП-Wnt, так как существует вероятность стимуляции канцерогенеза. Первые разработки терапевтического вмешательства на уровне этого сигнального пути для лечения ОП (антитела к склеростину) продемонстрировали благоприятный профиль безопасности и высокую эффективность в восстановлении МПКТ. Таким образом, исследование роли СП-Wnt в регуляции ОБГ расширяет возможности анаболической терапии ОП и создания препаратов, способствующих антирезорбтивному эффекту наряду с анаболическими.

Грант Российского научного фонда (проект № 15−15−30032).

Конфликт интересов отсутствует.