БК — бластные клетки
КМ — костный мозг
ОЛ — острый лейкоз
ОЛЛ — острый лимфобластный лейкоз/лимфома
ОЛ-СФ — ОЛ со смешанным фенотипом
ОМЛ — острый миелоидный лейкоз
ПЦМ — проточная цитометрия
Согласно классификации ВОЗ, выделяют 3 вида острого лейкоза (ОЛ) [1]: острый миелоидный лейкоз (ОМЛ) и родственные неоплазии из миелоидных предшественников; острый лимфобластный лейкоз/лимфома (ОЛЛ); наконец, ОЛ, для обозначения которого предложен термин «ambiguous» (неоднозначный, двусмысленный), который может быть интерпретирован как «неопределенный».
Данный термин представляется вполне оправданным, если принять во внимание, что при этом варианте ОЛ невозможно корректно верифицировать ни ОМЛ, ни ОЛЛ. Речь идет об остром недифференцированном лейкозе и ОЛ со смешанным фенотипом (mixed phenotype acute leukemia — MPAL) — ОЛ-СФ. В первом случае отсутствуют маркеры линейной принадлежности бластных клеток (БК), во втором одновременно выявляется экспрессия миелоидных и/или лимфоидных (В- и/или Т-клеточных) маркеров (не путать с аберрантной коэкспрессией лимфоидных или миелоидных маркеров на бластных клетках ОМЛ или ОЛЛ!).
У больных ОЛ со смешанным фенотипом антигены разных клеточных линий могут быть экспрессированы на одних и тех же бластах (ранее так называемый острый бифенотипичный лейкоз) или обнаруживается сосуществование популяций бластов разной клеточной направленности (ранее так называемый острый билинейный лейкоз).
В классификации ВОЗ ОЛ со смешанным фенотипом (ОЛ-СФ) представлен пятью подвариантами. Два из них характеризуются неслучайными хромосомными аберрациями, а именно транслокацией t (9;22)(q34;q11.2)/BCR-ABL1 и транслокацией t (v;11q23)/MLL. Остальные 3 подварианта: острый В-клеточный/миелоидный лейкоз, без дополнительных характеристик; острый Т-клеточный/миелоидный лейкоз, без дополнительных характеристик и острый В-клеточный/Т-клеточный/миелоидный лейкоз.
Необходимо отметить, что диагностика смешанно-линейной принадлежности БК — завершающий этап алгоритма обследования больных О.Л. Предварительно необходимо исключить случаи ОЛЛ и ОМЛ с аберрантной экспрессией антигенов, а также бластный криз хронического миелолейкоза. Таким образом, диагностика при ОЛ-СФ, как и во всех других случаях, строится по результатам комплексного обследования, обязательными элементами которого являются иммунологические и молекулярно-генетические исследования.
Это обосновано тем, что при обнаружении неслучайных хромосомных аберраций, типичных для ОМЛ, например транслокации t (8;21) или inv (16)/t (16;16) или выявлении клинических и лабораторных характеристик, соответствующих критериям диагностики ОМЛ с признаками миелодисплазии или вторичного ОМЛ после ранее проведенной цитостатической и/или лучевой терапии, устанавливается соответствующий диагноз, даже если результаты иммунофенотипирования БК соответствуют параметрам ОЛ-СФ.
Согласно классификации ВОЗ, для верификации ОЛ-СФ достаточно изучение небольшого числа маркеров, обладающих высокой степенью специфичности. Речь идет прежде всего о миелоидной и Т-клеточной направленности БК, которая может быть установлена при обнаружении соответственно миелопероксидазы и цитоплазматического или поверхностного антигена CD3. Что касается моноцитарной и В-клеточной направленности БК, то по причине отсутствия единственного высокоспецифичного для каждой из этих клеточных линий маркера рекомендовано расширить список изучаемых антигенов. Так, для того чтобы подтвердить В-клеточную направленность БК, следует выявить сочетание сильной экспрессии CD19 и сильной экспрессии одного из следующих антигенов: цитоплазматический CD79a, цитоплазматический CD22 или CD10. Вторая комбинация представлена слабой экспрессией CD19, но сильной экспрессией не менее 2 из 3 ранее указанных антигенов.
Основным методом диагностики ОЛ-СФ является проточная цитометрия (ПЦМ). Тем не менее, разбирая критерии, предложенные экспертами ВОЗ, следует обратить внимание на то, что в классификации не указан уровень экспрессии отдельных антигенов, который мог быть использован как пограничный показатель, необходимый для корректной верификации ОЛ-СФ. В ФГБУ РосНИИГТ ФМБА России условно приняты следующие значения: для линейно-неограниченных (СD34, CD38, HLA-DR) и цитоплазматических линейно-ассоциированных (специфических) позитивным считается уровень 10% и выше, для поверхностных линейно-ассоциированных антигенов — 20% и выше. E. Matutes и соавт. [2] в своей работе анализируют данные обследования 100 больных ОЛ-СФ, включая 59 с В-клеточным/миелоидным и 35 с Т-клеточным/миелоидным вариантами. У 98% из этих больных экспрессия миелопероксидазы выявлена не менее чем на 5% БК и только у 76% больных миелопероксидаза экспрессирована более чем на 20% БК. У 4 больных, которым не выполнена проточная цитометрия, миелоидная направленность БК установлена по результатам стандартного цитохимического исследования: в 5—9% бластов выявлена положительная реакция на миелопероксидазу и судан черный. При этом количество БК, коэкспрессирующих миелопероксидазу и лимфоидные маркеры, у отдельных больных варьировало от 5 до 95%.
Для выявления миелопероксидазы наряду с ПЦМ экспертами ВОЗ рекомендовано манипулировать результатами иммуногистохимического и цитохимического методов. Не менее информативными представляются и находки при световой микроскопии, в частности обнаружение такого специфического маркера миелоидной природы БК, как палочки Ауэра. В качестве примера можно привести описания двух клинических случаев острого Т-клеточного/миелоидного лейкоза, опубликованные в 2014 г. [3, 4]. У больных 15 и 28 лет при первичном обследовании выявлена тотальная инфильтрация костного мозга (КМ) БК, которые, как установлено по результатам ПЦМ, экспрессировали Т-клеточные антигены. Миелоидные и В-клеточные антигены при ПЦМ не обнаружены. Тем не менее у обоих больных диагностирован ОЛ-СФ. Основанием послужили находки при световой микроскопии и цитохимическом исследовании: палочки Ауэра и положительная окраска на миелопероксидазу соответственно в 6 и 3% БК.
Ранее авторы данной статьи сообщали о крайне редкой частоте ОЛ-СФ в их клинической практике: 1 из 132 больных ОЛ, которым выполнено иммунофенотипирование БК с применением расширенного набора моноклональных антител [5]. Вместе с тем данные литературы и накапливающийся собственный опыт свидетельствуют, что число больных ОЛ-СФ может быть несколько большим, если проводить совокупный анализ результатов морфологического, цитохимического, иммунологического и молекулярно-генетического исследований. Иллюстрацией данного тезиса может быть следующее клиническое наблюдение.
Больная О., 44 года, направлена в гематологическую клинику ФГБУ РосНИИГТ ФМБА России с предварительным диагнозом О.Л. За 2 нед до госпитализации в анализе крови, выполненном в связи с жалобами анемического характера, обнаружена бластемия до 10%. Для коррекции анемии больная получила трансфузии донорских эритроцитов. Цитостатические препараты не назначались. В анамнезе отсутствовали указания на предшествующие курсы химио- и/или лучевой терапии, а также на контакт с генотоксичными веществами.
При госпитализации состояние средней тяжести. Температура тела в норме. Бледность слизистых оболочек и кожи, без геморрагий. Периферические лимфатические узлы не увеличены. Печень и селезенка не пальпируются. В клиническом анализе крови гемоглобин 130 г/л, тромбоциты 55·109/л, лейкоциты 1,2·109/л, из них бласты 50%.
В пунктате КМ миелокариоциты 35,0·109/л, бласты 75%. Бластная популяция представлена бластами I и II типов, вариабельна по размеру и форме и однородна морфологически. Структура ядерного хроматина мелкозернистая, ядрышки (от 1 до 3) крупные, хорошо очерченные. Цитоплазма от голубых до базофильных тонов. Ядерно-цитоплазматическое соотношение в бластах II типа более низкое, чем в бластах I типа, с наличием нескольких крупных азурофильных гранул. В единичных клетках встречены палочки Ауэра, вакуолизация ядра цитоплазмы (рис. 1).
Цитохимические реакции на миелопероксидазу, липиды, кислую фосфатазу и PAS-реакцию в БК КМ отрицательные.
По результатам ПЦМ, выполненной на цитометре Beckman Coulter в пятицветном анализе, установлена В-лимфоидная направленность БК: CD34+ HLA-DR+CD38+CD117+cyCD79a+CD19+ CD20– CD22– MPO– CD117+ CD33– CD13+ cyCD3– CD7+ CD3– CD1a– СD2– CD5– CD10– CD64– CD14– CD56–. Экспрессия цитоплазматической миелопероксидазы обнаружена в 3,6% бластов. Тест на экспрессию цитоплазматического антигена CD3 отрицательный (рис. 2).
При стандартном цитогенетическом исследовании выявлены множественные поломки, соответствующие критериям комплексного кариотипа: mos46, XX, der (1), der (2)t (2;?)(p13;?), der (5)t (5;?)(p11;?), del (7)(q22),–10,–11,del (12)(p11), del (13)(q21),–14,+(1–)mar, парные фрагменты с вариациями [18]/46,ХХ [2]. Одновременно характер хромосомных аберраций соответствовал и критериям моносомного кариотипа [6]. Химерные гены BCR/ABL, AF4/MLL, E2A/PBX1, CBFb/MYH1, RUNX/RUNX1T1, а также мутации в генах NPM1 и FLT3 не обнаружены. Несмотря на негативные результаты цитохимического исследования и слабую экспрессию цитоплазматической миелопероксидазы по данным ПЦМ, диагностирован острый смешанный В-клеточный/миелоидный лейкоз без дополнительных характеристик. Основанием послужила находка палочек Ауэра в ряде бластов КМ при световой микроскопии. Дополнительным аргументом для окончательной верификации диагноза послужила высокая экспрессия миелоидного антигена CD13: на 93,4% БК.
После подписания больной информированного согласия инициирован поиск совместимого по HLA неродственного донора и начато лечение по протоколу ОЛЛ-2009. Данный протокол выбран из-за преимущественной экспрессии лимфоидных маркеров. Ввиду отсутствия клинически значимого уменьшения количества БК после завершения предфазы больная переведена на прием дексаметазона. Первый индукционный курс оказался неэффективным, морфологическая санация КМ не достигнута. Сиблингов у больной нет. Совместимых по HLA неродственных доноров в регистре доноров КМ ФГБУ РосНИИГТ ФМБА России не найдено. Продолжено лечение по схемам вне рамок какого-либо протокола в амбулаторных условиях.
ОЛ-СФ — редкий вариант у детей и взрослых. Его распространенность среди всех ОЛ не превышает 2—5% [7—9]. Тем не менее необходимость выделения данного варианта обосновывается прежде всего неудовлетворительными результатами лечения как цитостатическими препаратами, так и после выполнения трансплантации аллогенных гемопоэтических стволовых клеток [2, 10—13].
Выбор протокола для лечения больных ОЛ, характеризующегося коэкспрессией миелоидных и лимфоидных маркеров, всегда затруднителен. Используют протоколы для лечения больных как ОЛЛ, так и ОМЛ. Нередко применяют схемы, представляющие комбинацию препаратов, назначаемых больным ОМЛ и ОЛЛ. Предполагается, что проблема индивидуализации лечения может быть отчасти решена по результатам изучения профиля экспрессии микроРНК (miR-23a, miR-27a, miR-199b, miR-221 и miR-223) [14].
Несомненно, добавление иматиниба к цитостатической терапии в тех случаях, когда выявляется транслокация t (9;22), может значительно повысить частоту полных ремиссий, а также бессобытийную и общую выживаемость [15]. Однако необходимо учитывать, что наиболее частой находкой у больных ОЛ-СФ является комплексный кариотип, обнаруживаемый в 24—32% случаев [2, 10, 16].
Коэкспрессия на БК миелоидных и лимфоидных антигенов в совокупности с антигенами CD34 и CD117 дает основание предполагать возникновение ОЛ-СФ на уровне ранних стволовых клеток, еще обладающих способностью дифференцироваться и в лимфоидном, и в миелоидном направлениях. В то же время отсутствие уникального для всех больных молекулярно-генетического повреждения и, напротив, многообразие цитогенетических аберраций в случаях с нарушениями кариотипа позволяют обсуждать вопрос о биологической гетерогенности ОЛ-СФ [2]. Возможно, что именно вариабельность биологических механизмов, вовлеченных в формирование патологического клона, например в виде мутаций отдельных генов [10], может рассматриваться как причина того, что в ряде случаев морфологические, цитохимические и иммунологические находки отличаются от классических параметров, заданных в классификации ВОЗ. Примером может быть и представленное клиническое наблюдение, когда, несмотря на низкую экспрессию миелопероксидазы по данным ПЦМ (в 4% БК), в морфологических препаратах КМ выявлены палочки Ауэра.
В заключении необходимо еще раз подчеркнуть, что верификация варианта ОЛ должна осуществляться по результатам комплексного обследования больного. Несмотря на приоритетную роль метода ПЦМ в распознавании линейной принадлежности БК, корректная диагностика ОЛ-СФ возможна при сопоставлении данных иммунофенотипирования с результатами морфологического, цитохимического и молекулярно-генетического исследований. Трудности диагностики в совокупности с неудовлетворительными результатами лечения явились основанием для совместного с городскими гематологами обсуждения проблемы ОЛ-СФ. Принято решение о создании экспертной группы на базе гематологической клиники ФГБУ РосНИИГТ ФМБА России, целью работы которой планируется улучшение качества диагностики посредством анализа препаратов КМ и результатов иммунофенотипирования независимыми экспертами, а также разработка единого протокола лечения больных ОЛ-СФ.