АМ — альвеолярные макрофаги

БА — бронхиальная астма

БАЛЖ — бронхоальвеолярная лаважная жидкость

ГЭРБ — гастроэзофагеальная рефлюксная болезнь

ИГКС — ингаляционные глюкокортикостероиды

NF-κB — ядерный фактор транскрипции

В настоящее время доля пациентов с сочетанной патологией неуклонно увеличивается. Проблема современной медицины состоит в том, что изолированная терапия каждого заболевания сочетанной патологии часто оказывается малоэффективной. Становится очевидным, что без понимания особенностей патогенеза сочетанной патологии невозможно найти правильный подход к профилактике заболеваний и лечению таких пациентов [1, 2].

Одним из наиболее частых сочетаний является комбинация бронхиальной астмы (БА) и гастроэзофагеальной рефлюксной болезни (ГЭРБ) [3, 4]. Этиология и патогенез БА и ГЭРБ различны, однако при обоих заболеваниях имеется общий компонент — воспаление и нарушение адаптивного иммунного ответа в легких [5, 6].

Развитие воспаления и адаптивного ответа в значительной мере определяется макрофагами. Эти клетки врожденного ответа могут приобретать либо фенотип М1, который продуцирует преимущественно провоспалительные цитокины М1 и способствует развитию адаптивного ответа Th1, либо фенотип М2, который продуцирует противовоспалительные цитокины М2 и способствует развитию ответа Th2 [7—9]. Процесс смены фенотипа клеток называется репрограммирование. С учетом этих представлений мы выдвинули гипотезу о том, что нарушение иммунного ответа в легких при БА, ГЭРБ и сочетанной патологии связаны с нарушенным репрограммированием альвеолярных макрофагов (АМ).

Цель работы состояла в проверке этой гипотезы и оценке функционального фенотипа иммунного ответа в легких и фенотипа АМ больных БА, ГЭРБ и при сочетании этих заболеваний.

Характеристика групп обследованных. Сформированы 4 группы пациентов: больные БА персистирующего течения (n=15; 48,2±3,3 года), ГЭРБ (n=15; 46,4±4,2 года), их сочетанием (n=16; 49,3±3,6 года) и клинически здоровые лица (n=10; 51,8±3,5 года). Верификацию диагноза и терапию проводились в соответствии с действующими клиническими рекомендациями. Пациентам с БА и сочетанной патологией проводили терапию ингаляционными глюкокортикостероидами (ИГКС). В исследование включали больных в стадии ремиссии при отсутствие острого инфаркта миокарда, нестабильной стенокардии, недостаточности кровообращения IIБ—III стадии, острых нарушений мозгового кровообращения, пароксизмальных нарушений ритма сердца, гипертонического криза, дыхательной недостаточности III степени, онкологических заболеваний, туберкулеза, острых инфекционных заболеваний, нарушений свертывания крови, курения, беременности и кормления грудью. После добровольного подписания информированного согласия участникам исследования проводили фибробронхоскопию [10], результаты которой подтвердили наличие воспалительного компонента в бронхолегочной системе у больных всех групп. Дальнейшие исследования проводили на бронхоальвеолярной лаважной жидкости (БАЛЖ) и макрофагах, выделенных из БАЛЖ по методу Р. Orosi и соавт. [11].

Определение цитокинов в БАЛЖ и расчет функционального цитокинового фенотипа иммунного ответа в легких. БАЛЖ получали с помощью ФБС. Бронхоскоп (BF-B2, «Olympus», Япония) вводили в медиальный сегмент средней доли легкого. Для получения БАЛЖ вводили 6 порций стерильного изотонического раствора натрия хлорида по 20 мл с последующей аспирацией. Исследования выполняли по правилам GLP («надлежащей лабораторной практики») [12]. В БАЛЖ определяли содержание провоспалительных цитокинов М1: IL-1β, IL-8, IL-12p70, IFNγ, TNF-α и TNF-β; противовоспалительных цитокинов М2: IL-4, IL-5 и IL-10 и, цитокинов, обладающих свойствами популяции как М1, так и М2 (цитокинов М1/М2): IL-2 и IL-6 [13—15]. Содержание цитокинов оценивали методом проточной цитофлюориметрии (Beckman Coulter FC500, США) с помощью набора для определения цитокинов (BMS810FF, «BenderMedSystems», США) по инструкции производителя.

Содержание цитокинов в БАЛЖ зависит от суммарной их продукции всеми иммунными клетками в легких и отражает функциональный цитокиновый фенотип иммунного ответа в данном органе. Способ расчета изменения фенотипа иммунного ответа больных разработан нами впервые и представлен в разделе «Результаты».

Определение функционального цитокинового фенотипа АМ in vitro. Макрофаги представляют основную фракцию клеток БАЛЖ [16]. Вместе с тем в БАЛЖ содержатся и другие иммунные клетки, которые также могут продуцировать цитокины. Для того чтобы оценить вклад макрофагов в изменение цитокиновой структуры в легких при заболеваниях, мы оценили цитокиновый фенотип АМ больных и здоровых лиц в условиях монокультуры этих клеток. Макрофаги выделяли из БАЛЖ путем центрифугирования в течение 4 мин при 1000 об/мин. Полученный клеточный осадок ресуспендировали в 3 мл среды RPMI 1640. Количество клеток определяли в камере Горяева и доводили их концентрацию до 1⋅10⁶/мл [10]. Выделенную суспензию клеток размещали в 48-луночных культуральных планшетах по 0,5 млн клеток на лунку в 0,5 мл среды RPMI 1640 с FBS 10%, 100 ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина. Для стимуляции макрофагов добавляли липополисахарид (500 нг/мл) на 24 ч. После этого определяли фенотип макрофагов по содержанию цитокинов в среде, аналогично определению фенотипа иммунного ответа по содержанию цитокинов в БАЛЖ.

Статистический анализ данных проводили с помощью программы Statistica 8.0 (Statsoft). Результаты представлены в виде средних значений полученных показателей (М) и их ошибок (±m). Статистически значимыми считали различия при р<0,05.

Функциональный цитокиновый фенотип иммунного ответа в легких здоровых людей, больных ГЭРБ и БА и с их сочетанием. В табл. 1 представлены данные о содержании цитокинов в БАЛЖ больных и здоровых лиц. Для получения наиболее объективной количественной оценки изменения цитокинового фенотипа иммунного ответа необходимо учитывать два важных обстоятельства.

Во-первых, изменение фенотипа макрофагов в сторону провоспалительного варианта М1 может проявляться увеличением продукции цитокинов М1 на фоне снижения, неизменности или меньшей степени увеличения продукции цитокинов М2 либо это возможно даже при снижении продукции цитокинов М1, если оно развивается на фоне еще более низкого содержания цитокинов М2. Аналогичные соображения верны и для оценки изменения фенотипа в сторону варианта М2. Поэтому очевидно, что оценку изменения фенотипа иммунного ответа надо проводить по изменению отношения содержания цитокинов М1 к цитокинам М2 (индекс М1/М2), а не только по абсолютному количеству цитокинов М1 или М2.

Во-вторых, данные табл. 1 показывают, что при одном и том же заболевании изменение цитокинов одной и той же группы может происходить разнонаправлено. Например, в группе больных с сочетанной патологией содержание цитокина М1 IL-12 снижается, а другого цитокина М1 TNF-α увеличивается. Поэтому, если изменение фенотипа будет оцениваться только по отношению какого-либо одного цитокина М1 к какому-либо одному цитокину М2, то в зависимости от выбора пары цитокинов можно получить противоположные выводы о сдвиге фенотипа иммунного ответа при одной и той же патологии. В связи с этим с целью объективизации оценку изменения фенотипа иммунного ответа надо проводить по изменению отношения содержания большого количества цитокинов М1 к большому количеству цитокинов М2.

С учетом этих моментов изменение фенотипа иммунного ответа в легких у больных мы рассчитывали следующим образом. Сначала определяли кратность изменения содержания каждого цитокина в группе больных по сравнению с группой здоровых лиц (см. табл. 1, строки 1—6, 8—10, 12 и 13, значения в знаменателе). Затем рассчитывали среднюю кратность изменения цитокинов М1 (см. табл. 1, строка 7) и цитокинов М2 (см. табл. 1, строка 11). При этом если изменение концентрации цитокина было недостоверным, его кратность изменения принимали за 1. После этого рассчитывали индекс М1/М2 как отношение этих средних кратностей изменения (см. табл. 1, строка 15). В этом случае индекс М1/М2 выше 1 свидетельствует о сдвиге фенотипа иммунного ответа в сторону провоспалительного варианта М1, а значение меньше 1 — о сдвиге в сторону противовоспалительного варианта М2 по сравнению с фенотипом здоровых людей.

Результаты расчета показали, что индекс М1/М2 для больных ГЭРБ составил 4,20, для пациентов с сочетанной патологией — 0,60, а для больных БА — 0,88 (см. табл. 1, строка 15). Эти значения указывают на то, что при ГЭРБ происходит существенный сдвиг фенотипа иммунного ответа в сторону провоспалительного варианта М1, а при БА и сочетанной патологии — в сторону противовоспалительного варианта М2.

На рис. 1 изображена цитокиновая структура нарушенного иммунного ответа, при этом видно, что провоспалительный сдвиг при ГЭРБ связан с увеличением продукции цитокинов М1 IL-1β, IL-8, TNF-α и снижением продукции цитокина М2 IL-4, противовоспалительный сдвиг при БА — со снижением продукции цитокинов М1 IL-8, IL-12, IFN-γ, TNF-β и увеличением продукции цитокинов М2 IL-4 и IL-5, а противовоспалительный сдвиг при сочетанной патологии — со снижением продукции цитокинов М1 IL-1β, IL-8, IL-12, IFN-γ и увеличением продукции цитокина М2 IL-5. Наряду с наличием специфичности цитокиновой структуры при всех 3 заболеваниях обнаруживаются и общие черты: увеличение, хотя и в разной степени, содержания в БАЛЖ цитокинов TNF-α, IL-6 и IL-2 (см. рис. 1).

Из представленных диаграмм также следует, что внутри каждой группы цитокинов (М1 или М2) изменения имели разнонаправленный характер. Например, при БА продукция цитокина М1 IL-12 снизилась на 47,7%, а продукция другого цитокина М1 TNF-α, напротив, увеличилась на 322,5%. Это может указывать на наличие в БАЛЖ субпопуляций иммунных клеток как с провоспалительным, так и с противовоспалительным фенотипом.

В целом результаты оценки спектра цитокинов в БАЛЖ выявили серьезные деформации фенотипа иммунного ответа в легких у больных ГЭРБ в сторону провоспалительного ответа М1, а у больных БА — в сторону противовоспалительного ответа М2. Аналогичные выводы в отношении ГЭРБ и БА получены и другими исследователями [17—19]. В настоящей работе мы впервые показали, что при сочетанной патологии изменение иммунного ответа в легких происходит в сторону противовоспалительного фенотипа М2. Наша гипотеза состояла в том, что эти особенности иммунного ответа могут быть связаны с изменением фенотипа АМ.

Функциональный фенотип АМ здоровых лиц и пациентов. Фенотип А.М. мы оценивали по содержанию цитокинов в среде их культивирования. Результаты изучения фенотипа макрофагов свидетельствуют, что индекс М1/М2 для больных ГЭРБ составил 2,52; для лиц с сочетанной патологией — 0,84; для пациентов с БА — 1,59 (табл. 2, строка 15). Эти значения указывают на то, что при ГЭРБ и при БА изменение фенотипа АМ происходило в сторону варианта М1, а при сочетанной патологии — в сторону варианта М2.

Диаграммы на рис. 2 показывают, что провоспалительный сдвиг фенотипа макрофагов у больных ГЭРБ связан с увеличением продукции цитокинов М1 IL-8, TNF-β и снижением содержания цитокина М2 IL-5; провоспалительный сдвиг у пациентов с БА — с увеличением продукции цитокинов М1 IL-8, IL-12 и TNF-β и снижением выработки цитокина М2 IL-5; при этом противовоспалительный сдвиг при сочетанной патологии связан со сниженным уровнем цитокинов М1 IFN-γ и TNF-α и увеличением синтеза цитокинов М2 IL-5 и IL-10.

Наряду со специфичными для каждого вида патологии изменениями продукции цитокинов макрофагами, при ГЭРБ, БА и их сочетании существуют и общие по направленности изменения, хотя и выраженные в разной степени. Речь идет о повышенной выработке цитокинов М1 IL-8 и TNF-β, увеличении содержания цитокина М2 IL-10 и повышенном уровне цитокина М1/М2 IL-6 (см. рис. 2; см. табл. 2).

При анализе продукции цитокинов макрофагами мы также обнаружили, что внутри каждой группы цитокинов изменения разнонаправлены. Например, при БА продукция цитокинов М1 IL-8 и IL-12 существенно увеличивалась, а продукция других цитокинов М1 IFN-γ и TNF-α, напротив, снижалась (см. табл. 2). Это может указывать на гетерогенность популяции макрофагов, выделенной от больных, и наличие субпопуляции макрофагов с фенотипом как М1, так и М2.

В результате проведенного исследования мы обнаружили, что пациенты с ГЭРБ, БА и при сочетании этих заболеваний имеют в каждом случае свои, характерные только для данного состояния, изменения содержания цитокинов в БАЛЖ (см. рис. 1). Наличие такой специфичности, очевидно, отражает особенности нарушения иммунного ответа в легких, а также различие этиологических факторов, которые действуют на иммунную систему при этих заболеваниях. Специфичность цитокиновой структуры важно учитывать при разработке способов коррекции нарушенного иммунного ответа. Так, данные рис. 1 дают основание полагать, что провоспалительный сдвиг при ГЭРБ целесообразно корригировать за счет снижения продукции цитокинов М1 IL-1β, IL-8, TNF-α, выработка которых увеличена, и/или за счет стимуляции продукции цитокина М2 IL-4, синтез которого снижен. Ограничивать продукцию других цитокинов М1, таких как IL-12 или TNF-β, или увеличивать выработку цитокина М2 IL-10 при ГЭРБ нецелесообразно, потому что содержание этих цитокинов при данном заболевании соответствует их уровню у здоровых людей. Предварительное определение состава цитокинов у каждого конкретного больного могло бы повысить эффективность коррекции иммунного ответа в легких.

Выявлены также изменения и общего характера в содержании цитокинов в БАЛЖ при ГЭРБ, БА и сочетании этих видов патологии: увеличение содержания цитокина М1 TNF-α и цитокинов М1/М2 IL-6 и IL-2 (см. рис. 1). Это подтверждает наличие общего провоспалительного компонента в легких при всех 3 состояниях. Важную роль в развитии данного воспалительного компонента, вероятно, играет ядерный фактор транскрипции — NF-κB. Этот фактор вовлечен в процессы синтеза провоспалительных цитокинов и его активация, действительно, происходит в легких при повреждении, инфекциях, БА и других заболеваниях [20—22]. Поэтому NF-κB заслуживает внимания в качестве терапевтической мишени при лечении легочных осложнений ГЭРБ, БА и сочетанной патологии.

Кроме того, оказалось, что при каждом из заболеваний в БАЛЖ происходят разнонаправленные изменения содержания цитокинов одной и той же группы — М1 или М2. Это может быть связано с неоднородностью популяции иммунных клеток в БАЛЖ больных. Например, доминирующей при ГЭРБ, очевидно, является «патогенетическая» популяция макрофагов М1, которая запускает чрезмерное воспаление, тогда как реакция противовоспалительной, «терапевтической» популяции М2 представлена увеличением синтеза противовоспалительного цитокина М2 IL-5. Фенотипическую гетерогенность иммунных клеток целесообразно учитывать при разработке новых методов коррекции иммунного ответа. Например, при ГЭРБ было бы целесообразно ограничивать продукцию провоспалительных цитокинов в популяции иммунных клеток М1и увеличивать продукцию противовоспалительных цитокинов в популяции М2. Специфические маркеры фенотипа на поверхностности иммунных клеток дают возможность для зависимой от фенотипа доставки блокаторов или активаторов синтеза цитокинов.

В дальнейшем проанализированы изменения цитокинового фенотипа макрофагов, выделенных из БАЛЖ больных с различной патологией. Оказалось, что, как и в случае нарушения цитокинового фенотипа иммунного ответа (см. рис. 1), при ГЭРБ, БА и их сочетании имеется характерный для каждого состояния цитокиновой структуры активности АМ (см. рис. 2) и наличие общих для всех изменений. Общим явилось увеличение продукции цитокинов М1 IL-8 и TNF-β, цитокина М2 IL-10 и цитокина М1/М2 IL-6 (см. табл. 2; см. рис. 2). Увеличение продукции цитокинов М1, вероятно, отражает общий провоспалительный компонент, а увеличение противовоспалительного цитокина М2— компенсаторную реакцию макрофагов и в целом врожденного ответа при всех 3 заболеваниях.

Выявлено также, что продукция разных цитокинов одной и той же группы (М1 или М2) меняется разнонаправлено, и это позволило предположить связь данного феномена с фенотипической неоднородностью А.М. Ранее с помощью поверхностных клеточных маркеров фенотипа показано, что популяция макрофагов БАЛЖ здоровых людей, а также пациентов с ГЭРБ, БА и сочетанной патологией состоит из макрофагов как М1, так и М2 [23]. Эти данные дают еще больше оснований для разработки зависимой от фенотипа коррекции иммунного ответа при заболеваниях легких.

Для проверки нашей гипотезы важно было сравнить характер изменений цитокинов в БАЛЖ (см. рис. 1), где в продукцию цитокинов вносят вклад все иммунные клетки, и в среде культивирования изолированных макрофагов (см. рис. 2). При интерпретации такого сравнения необходимо учитывать, что иммунные клетки в БАЛЖ находились в организме и оказывались под влиянием этиологических факторов заболевания и лекарственных препаратов, а изолированные макрофаги — в условиях культуральной среды и активировались только бактериальным липополисахаридом. С учетом этого можно сделать два качественных вывода.

Во-первых, оказалось, что изменение функционального фенотипа АМ у больных ГЭРБ в сторону М1 и при сочетанной патологии в сторону М2-варианта (см. табл. 2, строка 15) совпадает с изменением фенотипа иммунного ответа (см. табл. 1, строка 15) в легких. У больных БА изменение фенотипа иммунного ответа в легких происходит в сторону варианта М2 (см. табл. 1, строка 15), а изменение собственного фенотипа АМ — в сторону варианта М1 (см. табл. 2, строка 15). При интерпретации этого сопоставления надо учитывать, что больные БА принимали ИГКС, которые могут репрограммировать макрофаги в сторону противовоспалительного фенотипа М2 [24]. При культивировании макрофагов больных БА в среде не было ИГКС и макрофаги проявляли свой истинный провоспалительный фенотип М1. Этот фенотип, вероятно, формирует провоспалительный компонент и может провоцировать обострение БА, связанное с острой воспалительной реакцией [25]. В целом проведенный сравнительный анализ поддерживает нашу гипотезу о важной роли репрограммирования макрофагов в патогенезе нарушения иммунного ответа в легких.

Во-вторых, наши данные показали, что при всех заболеваниях изменения содержания IL-2 в БАЛЖ очень существенны и доходят до 500% при ГЭРБ (см. табл. 2, строка 12), а в среде культивирования макрофагов — лишь незначительны: при ГЭРБ на 63,9%, при сочетанной патологии на 37,2%; при БА изменения и вовсе отсутствовали (см. табл. 1, строка 12). Чтобы понять причину этих отличий, надо учитывать, что основным источником IL-2 являются клетки Th1 [22]. В легких и БАЛЖ эти клетки есть, а в среде культивирования макрофагов — нет. Таким образом, наши данные показывают, что клетки адаптивного ответа также вносят вклад в нарушение иммунного ответа при заболеваниях легких. При этом, судя по данным табл. 1 (строка 12), вклад клеток Th1 (оцененный по продукции IL-2) в нарушение цитокинового фенотипа иммунного ответа при ГЭРБ и БА существенно выше, чем при сочетанной патологии.

Таким образом, анализ спектра цитокинов в БАЛЖ и определение содержания цитокинов, продуцируемых АМ in vitro, при БА, ГЭРБ и их сочетании подтвердили гипотезу, о том, что нарушения иммунных ответов в легких при этих заболеваниях связаны с изменением репрограммирования макрофагов. Это позволяет инициировать развитие нового клинического направления — исследование нарушений репрограммирования иммунных клеток в патогенезе заболеваний легких и при сочетанных патологиях. Наши результаты также дают важное указание на то, что терапию воспалительного компонента при указанных состояниях необходимо проводить с учетом специфичности цитокиновой структуры иммунного ответа и фенотипической неоднородности иммунных клеток.