Несмотря на большое число исследований, посвященных проблеме рестеноза, механизмы его развития до конца неясны. Повреждение сосудистой стенки, происходящее во время коронарного стентирования (КС), инициирует каскад последовательных процессов, включающих острый воспалительный ответ, миграцию и последующую пролиферацию синтезирующих экстрацеллюлярный матрикс гладких мышечных клеток [1, 2]. Избыточный пролиферативный ответ и формирование клетками избыточного количества внеклеточного матрикса приводит к гиперплазии неоинтимы - основной причине возникновения рестеноза после имплантации стентов [3-5]. Восстановление сосудистой стенки сопровождается не только активацией стромальных клеток, но и вовлечением в процессы пролиферации ряда других клеточных популяций, в том числе клеток крови. В последние годы высказано предположение о том, что одной из возможных причин возникновения рестеноза после имплантации стентов, покрытых лекарственным веществом (СЛП), может быть реакция локальной гиперчувствительности на полимерное покрытие стентов - процесс, в котором эозинофилы играют важную роль [6, 7]. Массивная инфильтрация клетками воспаления, в том числе эозинофилами, стенки коронарной артерии в месте развития рестеноза после имплантации стента, покрытого сиролимусом, продемонстрирована H. Hao и соавт. [8]. Показана связь между количеством эозинофилов в крови и риском смерти у пациентов с ишемической болезнью сердца (ИБС), подвергшихся коронарной ангиопластике [9]. В то же время исследования, посвященные данной проблеме, немногочисленны. Целью настоящего исследования явилось изучение роли эозинофильных гранулоцитов в развитии рестеноза после имплантации СЛП.

Под наблюдением находились 170 больных с хроническими формами ИБС, мужчины и женщины, в возрасте от 35 до 75 лет, в том числе 80 пациентов, которым в течение первого года после имплантации СЛП проведена коронарография (КГ); 75 больных, впервые подвергшихся КС, а также 15 пациентов с ИБС, подтвержденной при КГ.

В исследование не включали пациентов с нестабильной стенокардией, в первые 2 мес после перенесенного инфаркта миокарда, с острым нарушением мозгового кровообращения, операцией коронарного шунтирования в анамнезе, ангиопластикой по поводу рестеноза в анамнезе, снижением фракции выброса левого желудочка менее 40%, застойной сердечной недостаточностью, повышением уровня креатинина в крови более 150 мкмоль/л, диффузными заболеваниями соединительной ткани (ревматизм, ревматоидный артрит и др.), клиническими и лабораторными признаками острого инфекционного заболевания, тяжелыми хроническими заболеваниями (онкологические, гематологические и др.) и увеличением количества эозинофилов в крови более 700 клеток в 1 мкл (для исключения гиперэозинофилии, вызванной лекарственной аллергией, аллергической сенсибилизацией организма и др.).

Исследование состояло из 3 последовательно выполненных этапов, результаты каждого из них служили предпосылкой для проведения следующего этапа. На первом этапе изучена связь между уровнем циркулирующих положительных по остеонектину клеток крови и полиморфно-ядерных лейкоцитов с развитием рестеноза после имплантации СЛП. В исследование включили 48 мужчин и женщин с ИБС, которым в течение первого года после эндоваскулярной реваскуляризации миокарда (ЭВРМ) с помощью стентов, покрытых сиролимусом (Sypher, «Cordis», США), в плановом порядке выполнена КГ. При проведении анализа клеток крови методом проточной цитофлуориметрии выявлены клетки, обладающие интенсивной автофлюоресценцией по каналу FL-1 (рис. 1).

На втором этапе изучен уровень катионного белка эозинофилов (КБЭ), а также эозинофильного нейротоксина у больных с рестенозом после имплантации стентов, покрытых сиролимусом (Sypher, «Cordis», США). В исследование включили 32 пациентов (мужчин и женщин) с ИБС, которым в течение первого года после ЭВРМ с помощью СЛП в плановом порядке проведена КГ. Контрольную группу составили 15 больных с верифицированным посредством КГ диагнозом ИБС, но не подвергавшихся ранее ЭВРМ. По результатам КГ пациентов распределили на 2 группы. В 1-ю группу вошли 13 больных, у которых отмечено возникновение рестеноза, во 2-ю группу - 19 пациентов без рестеноза. У пациентов обеих групп проведено сравнение клинической и ангиографической характеристик (количество пораженных магистральных артерий, окклюзий, бифуркационных стенозов, протяженных стенозов, артерий малого диаметра). Всем пациентам проведено измерение уровня КБЭ, эозинофильного нейротоксина, высокочувствительного С-реактивного белка (вч-СРБ), иммуноглобулина E (IgE) в сыворотке крови, а также сопоставление уровня этих показателей среди пациентов с рестенозом, без рестеноза и контрольной группы.

Заключительным этапом исследования стала оценка динамики уровня КБЭ в течение года после КС. Под наблюдением находились 75 больных ИБС - мужчин и женщины, подвергшихся в плановом порядке КС. Всех пациентов разделили на 2 группы. В 1-ю группу вошли 60 больных, которым были имплантированы стенты, покрытые сиролимусом (Sypher, «Cordis», США) и эверолимусом (Promus, «Boston Scientific», США), во 2-ю группу -15 пациентов после ЭВРМ с помощью стентов без покрытия лекарственным веществом (СбЛП). У пациентов обеих групп проведено сравнение клинической и ангиографической характеристик (количество пораженных магистральных артерий, окклюзий, бифуркационных стенозов, протяженных стенозов, артерий малого диаметра). У всех больных перед стентированием, на 1, 5 и 7-й дни, а также через 2, 6 и 12 мес после ЭВРМ в крови определены уровни КБЭ, IgE и вч-СРБ. Выполнено сопоставление уровня этих показателей в динамике у пациентов, которым имплантированы СЛП, и у больных, которым имплантированы СбЛП.

При определении уровня КБЭ кровь для исследования брали из локтевой вены утром натощак после двенадцатичасового голодания в 2 пробирки (S-Monovette, SARSTEDT): с активатором свертывания для получения сыворотки и с ЭДТА для получения плазмы. Образец крови в пробирке, предназначенный для получения сыворотки, после полуторачасовой инкубации при температуре 19 °С центрифугировали в течение 15 мин при температуре 19 °С при 1500 g. Супернатант отбирали в отдельные пробирки и хранили при температуре –70 °С. После размораживания уровень КБЭ определяли иммуноферментным методом в соответствии с рекомендациями к набору Immulite-1000 ECP («Siemens Healthcare», Великобритания) на автоматическом хемилюминесцентном анализаторе Immulite-1000 («DPC-Siemens», США). Образец крови, стабилизированный ЭДТА, центрифугировали в течение 15 мин при температуре 4 °C при 1500 g. Плазму отбирали в отдельные пробирки и хранили при температуре –70 °С. После размораживания готовили образцы для измерения коэффициента поглощения на медицинском анализаторе Униплан («ПИКОН», Россия) в соответствии с рекомендациями к набору ECP ELISA Kit («MBS», США), после чего проводили подсчет уровня КБЭ. Для КБЭ диапазон регистрируемых значений составлял 0,5-200 нг/мл с коэффициентом вариации не более 4%.

При определении уровня эозинофильного нейротоксина кровь для исследования брали из локтевой вены пациентов утром натощак после двенадцатичасового голодания в пробирки с ЭДТА (S-Monovette, SARSTEDT). После десятиминутной инкубации при температуре 19 °С центрифугировали в течение 10 мин при 1500 g при температуре 4 °С, плазму отбирали в отдельные пробирки и хранили при температуре –70 °С. После размораживания 50 мкл плазмы добавляли к 200 мкл раствора-разбавителя. Затем, следуя рекомендациям к набору EDN ELISA Kit («MBL», Япония), готовили образцы для измерения коэффициента поглощения на медицинском анализаторе Униплан («ПИКОН», Россия), после чего проводили подсчет уровня эозинофильного нейротоксина. Диапазон значений эозинофильного нейротоксина в плазме крови здоровых добровольцев согласно рекомендациям к набору EDN ELISA Kit («MBL», Япония) составлял 18,1 (6,2-49,8) нг/мл.

Уровень С-реактивного белка определяли высокочувствительным нефелометрическим методом на автоматическом лазерном нефелометре BN-proSpec («Dade-Behring», Германия). Уровень IgE в плазме крови определяли иммуноферментным методом на автоматическом хемилюминесцентном анализаторе Immulite-1000 («DPC-Siemens», США).

Статистический анализ данных проведен с помощью программного пакета Statistica 6. Все собранные в ходе исследования данные представлены в виде медианы, 25-го и 75-го процентилей. Для проверки статистических гипотез о виде распределения использовали критерий W Шапиро-Уилка. Для сравнительного анализа данных, полученных в двух группах, использовали точный критерий Фишера и критерий U Манна-Уитни, в нескольких группах - критерий &khgr;² и критерий ANOVA по Краскелу-Уоллису. Для анализа множества повторных измерений в одной и той же группе применяли критерий Фридмана, для парного сравнения повторных измерений - критерий Вилкоксона. Различия считали статистически значимыми при p<0,05.

Пациенты с рестенозом (n=20) и больные без рестеноза (n=28), у которых проведен анализ состава различных субпопуляций ядросодержащих клеток крови (первый этап), не различались по возрасту, соотношению мужчин и женщин, курящих и некурящих, а также наличию гиперлипидемии (ГЛП) и сахарного диабета (СД). Число больных со стенокардией II-IV функционального класса (ФК) было сопоставимым в обеих группах. У одинакового числа пациентов имелись постинфарктный кардиосклероз и артериальная гипертония (АГ). У больных обеих групп одинаково часто осуществлялось стентирование передней нисходящей (ПНА), огибающей (ОА) и правой коронарной артерии (ПКА). Одинаково часто осуществлялось стентирование бифуркационных стенозов, окклюзий, протяженных стенозов, артерий малого диаметра.

Количество эозинофильных гранулоцитов с высоким уровнем автофлюоресценции в крови пациентов, у которых развился рестеноз после имплантации СПЛ, оказалось значительно выше, чем в крови пациентов без рестеноза (рис. 2).

Пациенты с рестенозом (n=13), без рестеноза (n=19), а также лица, вошедшие в контрольную группу (n=15), у которых изучалась динамика уровня КБЭ и эозинофильного нейротоксина (второй этап), не различались между собой по возрасту, соотношению мужчин и женщин, курящих и некурящих. Число больных со стенокардией II-IV ФК оказалось сопоставимым во всех группах. У одинакового числа пациентов имелись безболевая ишемия миокарда, постинфарктный кардиосклероз, АГ, ГЛП и СД. Больным первых 2 групп одинаково часто проводили стентирование ПНА, ОА и ПКА, протяженных (>20 мм) стенозов, артерий малого (<2,75 мм) диаметра, окклюзий, а также бифуркационных стенозов.

Уровень КБЭ в плазме крови пациентов, у которых возник рестеноз после имплантации СЛП, статистически значимо выше (p=0,017), чем у больных без рестеноза, и составил 17,7 (11,2; 24) и 9 (6,4; 12,9) нг/мл соответственно (рис. 3).

Пациенты, которым имплантированы СЛП (n=60), и больные после ЭВРМ с помощью СбЛП (n=15), у которых оценена динамика уровня КБЭ в течение года после КС (третий этап), не различались по возрасту, соотношению мужчин и женщин, курящих и некурящих. Число больных со стенокардией II-IV ФК оказалось сопоставимым в обеих группах. У одинакового числа больных имелись постинфарктный кардиосклероз, безболевая ишемия миокарда, АГ, ГЛП и СД. У больных обеих групп одинаково часто встречалось поражение 1, 2 и 3 магистральных коронарных артерий. У больных обеих групп одинаково часто осуществлялось стентирование ПНА, ОА и ПКА. Одинаково часто осуществлялось стентирование окклюзий и артерий малого диаметра. У больных, которым имплантированы СЛП, чаще проводили стентирование протяженных и бифуркационных стенозов.

Уровень КБЭ перед имплантацией СЛП составил 7,8 (6,4; 8,7) нг/мл (рис. 5), при этом в 1, 3 и 7-й дни, а также через 2 мес после стентирования статистически значимо не отличался от исходного и равнялся 7,9 (6,2; 8,9), 7,6 (5,6; 8,4), 7,5 (5,6; 8,3) и 7,3 (6,55; 8,6) нг/мл соответственно.

В 1-й день после имплантации СЛП отмечено повышение уровня вч-СРБ. На 3-й день данный показатель вернулся к исходному значению. В последующем статистически значимая динамика уровня СРБ не выявлялась. На 1-й день после имплантации СбЛП уровень вч-СРБ также был статистически значимо выше исходного. На 3-й и 7-й дни после стентирования отмечено прогрессивное снижение данного показателя. В последующем уровень вч-СРБ вернулся к исходному и его статистически значимая динамика не выявлялась. Статистически значимой динамики уровня IgE в сыворотке крови у больных в течение всего периода наблюдения не было (p=0,78).

При анализе различных популяций лейкоцитов после имплантации СЛП в крови пациентов с рестенозом по сравнению с пациентами без рестеноза обнаружено большее количество эозинофильных гранулоцитов. Кроме того, выявлено, что частота возникновения рестеноза у больных с количеством эозинофилов больше медианы распределения статистически значимо выше, чем у пациентов с количеством эозинофилов менее медианы распределения. Полученные данные могут свидетельствовать об участии эозинофильных гранулоцитов в формировании рестеноза. Возможность участия эозинофилов в возникновении рестеноза подтверждается результатами исследований других авторов. Так, в исследовании I. Toor и соавт. [9] показано, что уровень эозинофилов в крови перед чрескожным коронарным вмешательством выше медианы распределения связан с повышенным риском смерти через 6 мес после эндоваскулярного вмешательства. В исследовании R. Virmani и соавт. [12] обнаружена инфильтрация эозинофилами стенки коронарной артерии в месте имплантации стентов, покрытых сиролимусом. A. Finn и соавт. [13] провели сравнение характера клеточной инфильтрации в местах имплантации СбЛП и СЛП в артериях свиней. По данным гистологического исследования, через 6 мес после имплантации стентов, покрытых сиролимусом или паклитакселем, в месте вмешательства обнаруживалась выраженная эозинофильная и грануломатозная инфильтрация. В то же время после реваскуляризации миокарда с помощью СбЛП подобной клеточной инфильтрации не выявлено. Возможным объяснением полученных результатов, по мнению авторов, может быть возникновение локальной реакции гиперчувствительности к нерастворимому полимеру в стентах обоих типов либо к лекарственному препарату, выделяемому из стента в просвет сосуда [13]. Инфильтрация стенки коронарной артерии эозинофилами в месте развития рестеноза после имплантации СЛП продемонстрирована рядом других исследователей [8, 14, 15].

Гранулы эозинофилов содержат уникальные основные белки, в том числе большой основной белок, КБЭ, эозинофильную пероксидазу, эозинофильный нейротоксин, а также β-глюкуронидазу. Эти белки высвобождаются при активации эозинофилов и играют важную роль в эффекторной функции эозинофилов [16]. Из основных белков КБЭ является одним из наиболее широко используемых клинических маркеров активации эозинофилов. Полученное нами различие по уровню эозинофилов в группах пациентов с рестенозом и без такового позволило выдвинуть предположение о том, что развитие гиперплазии неоинтимы после имплантации СЛП может сопровождаться активацией и дегрануляцией эозинофилов с выделением КБЭ в системный кровоток. Согласно результатам настоящего исследования более высокий уровень КБЭ в плазме крови после имплантации СЛП сопровождается более частым развитием рестеноза. Подъем уровня КБЭ не связан ни с интенсивностью воспалительных процессов, которые оценивали по уровню вч-СРБ, ни с развитием зависимых от IgE аллергических реакций. Анализ динамики уровня КБЭ после имплантации СЛП показал, что он повышается со 2-го месяца после ЭВРМ и достигает максимального значения через 12 мес после вмешательства. В то же время после имплантации СбЛП уровень КБЭ не отличается от исходного.

Связь уровня КБЭ в крови с развитием выраженных кардиальных осложнений (повторная реваскуляризация миокарда, инфаркт миокарда или смерть от ИБС) в течение первого года после ЭВРМ с помощью стентов, покрытых сиролимусом или паклитакселем, показана итальянскими исследователями [17]. Выдвинуто предположение о том, что вероятным фактором активации эозинофилов является гиперчувствительность к полимеру [9, 18]. Это косвенно подтверждается результатами экспериментальных исследований. Так, выявлены воспалительная реакция и утолщение интимы в стентированном сегменте после имплантации стентов, покрытых различными биополимерами [19].

Количество эозинофильных гранулоцитов в крови пациентов, у которых отмечено возникновение рестеноза после имплантации СЛП, статистически значимо выше, чем у больных без рестеноза, что свидетельствует об участии этой популяции клеток в его возникновении.

У пациентов, подвергшихся КС с помощью СЛП и имеющих более высокий (выше медианы распределения) уровень КБЭ в крови, частота возникновения рестеноза выше, чем у пациентов с более низким (ниже медианы распределения) уровнем этого белка. Подобный факт позволяет предположить наличие воспалительной реакции с вовлечением эозинофилов в месте возникновения рестеноза.

ЭВРМ с помощью СЛП в отличие от имплантации СбЛП вызывает повышение уровня КБЭ, которое обнаруживают через 6-12 мес после коронарной ангиопластики.