Системные аутоиммунные ревматические заболевания (САРЗ) - гетерогенная группа иммуновоспалительных болезней человека, включающая ревматоидный артрит (РА), системную красную волчанку (СКВ), системную склеродермию (ССД), синдром Шегрена (СШ), идиопатические воспалительные миопатии - ИВМ (полимиозит - ПМ/дерматомиозит - ДМ), антифосфолипидный синдром (АФС) и системные васкулиты, ассоциированные с антинейтрофильными цитоплазматическими антителами - АТ (АНЦА-СВ) [1]. В основе патогенеза САРЗ лежат разно­образные генетические дефекты, персистирующая активация клеток адаптивного (Тh1-, Th17-, В-лимфоцитов) и врожденного (моноцитов/макрофагов, дендритных клеток, нейтрофилов, естественных киллеров, тучных клеток) иммунитета, гиперпродукция аутоантител (аутоАТ), синтез провоспалительных цитокинов, хемокинов, факторов роста, внутриклеточных сигнальных молекул, протеаз и других медиаторов, индуцирующих воспаление и деструкцию тканей организма [2, 3]. САРЗ характеризуются тяжелым непрерывно прогрессирующим течением, частым развитием сочетанных заболеваний и неблагоприятным прогнозом [4, 5]. Ранняя лабораторная диагностика [6, 7] и активная противовоспалительная и иммуносупрессивная терапия в дебюте болезни [8-10] увеличивают вероятность достижения ремиссии и снижают риск развития необратимого повреждения внутренних органов и тканей при большинстве САРЗ. Исследование молекулярных и клеточных биомаркеров позволяет оценить активность патологического процесса, прогноз заболевания, а также прогнозировать эффективность лечения, что особенно важно в случае фармакотерапии с применением генно-инженерных биологических препаратов (ГИБП) [6, 7].

Прогресс в диагностике САРЗ связан с бурным развитием иммунологических и молекулярно-биологических методов определения широкого спектра лабораторных биомаркеров в крови, синовиальной жидкости, моче, биоптатах синовиальной оболочки, почек и других пораженных тканей. В 1950-1960 гг. разработаны «классические», моноплексные методы иммунохимического анализа первого поколения (пассивная агглютинация, фиксация комплемента, иммунопреципитация, двойная иммунодиффузия, встречный иммуноэлектрофор, непрямая реакция иммунофлюоресценции (НРИФ) для качественного и полуколичественного измерения аутоАТ в сыворотке крови. В 1970-1980 гг. появились количественные методы моноплексного иммунохимического анализа второго поколения (радиоиммунный и иммуноферментный анализ - ИФА, иммуноблот, иммунодот, иммунонефелометрия, иммунохемилюминесцентный анализ, иммунофлюорометрический анализ и др.). К концу XX века автоматизация данных технологий привела к возникновению методов иммунометрического анализа третьего поколения, способствовавших стандартизации и повышению аналитической надежности лабораторных исследований. Последнее десятилетие отмечено быстрым внедрением в лабораторную практику методов мультиплексного анализа, основанных на генетических, эпигеномных, транскриптомных и протеомных технологиях с использованием ДНК- и белковых микрочипов, полимеразной цепной реакции и проточной цитометрии [6, 11]. В отличие от моноплексных методов, мультиплексные аналитические системы позволяют одновременно определять 100 и более различных биомаркеров в небольшом объеме биологической жидкости (50 мкл), что наряду с увеличением производительности и экономической эффективности исследования значительно улучшает внутри- и межлабораторную сопоставимость полученных результатов.

В ревматологии наиболее широкое распространение получили протеомные технологии мультиплексного иммунного анализа, которые наиболее полно и объективно отражают сложность и многообразие молекулярных механизмов патогенеза САРЗ. В настоящее время разработаны коммерческие тест-системы на основе планарных и суспензионных микрочипов для определения профилей аутоАТ и ряда других белковых биомаркеров САРЗ (показателей острой фазы воспаления, цитокинов, хемокинов, факторов роста, молекул адгезии клеток, маркеров метаболизма хрящевой и костной ткани, металлопротеиназ, маркеров апоптоза, сигнальных молекул) [6, 7, 12, 13].

Патологическая активация В-клеток и гиперпродукция органонеспецифических аутоАТ являются характерными признаками большинства САРЗ [8]. К основным серологическим маркерам САРЗ относятся антинуклеарные АТ (АНА), ревматоидные факторы (РФ), АТ к цитруллинированным белкам (АЦБ), антифосфолипидные АТ (АФЛ) и антинейтрофильные цитоплазматические АТ (АНЦА). Положительные результаты определения этих аутоАТ входят в число диагностических и классификационных критериев САРЗ (табл. 1) [14-22]; применяются для оценки активности, прогноза и идентификации отдельных клинико-лабораторных подтипов САРЗ (табл. 2); служат предикторами развития данных заболеваний на доклинической стадии [23].

Новые технологии твердофазного анализа аутоАТ, включая автоматизированные мультиплексные диагностические платформы, обладают более высокой аналитической чувствительностью и надежностью по сравнению с обычными методами иммунодиффузии, агглютинации и иммунофлюоресценции. Это создает предпосылки для характеристики «профилей» аутоАТ у ранее «серонегативных» больных САРЗ, эффективного мониторинга уровня аутоАТ на фоне лечения, уточнения связи между концентрацией аутоАТ в сыворотке крови, активностью патологического процесса и тяжестью повреждения внутренних органов, расширения представлений о патогенетическом и прогностическом значении аутоАТ [11, 14].

Вместе с тем клиническая информативность новых иммунометрических методов определения аутоАТ остается недостаточно изученной [24]. К одной из наиболее актуальных проблем лабораторной диагностики САРЗ относится необходимость стандартизации современных методов выявления аутоАТ на преаналитическом, аналитическом и постаналитическом этапах исследования, в том числе создание международных референтных материалов для калибровки и внешней оценки качества иммунологических тестов [14]. Разработка новых проектов и инициатив, касающихся гармонизации тестирования аутоАТ, проводится несколькими международными комитетами и организациями. В начале 80-х годов прошлого века создан Комитет по стандартизации методов определения аутоАТ (Autoantibody Standardization Committee), который совместно с Фондом артритов (Аrthritis Foundation), Всемирной организацией здравоохранения, Центром по контролю и профилактике заболеваний США (US Centre for Diseases Control and Prevention) и Международным союзом иммунологических обществ (International Union of Immunological Societies) начал проводить отбор, хранение и распространение референтных образцов моноспецифических сывороток к различным аутоантигенам. В 2002 г. Европейская инициативная группа по стандартизации диагностики аутоиммунных заболеваний (European Autoimmune Standardization Initiative), помимо работы над гармонизацией методов исследования аутоАТ, способствовала оптимизации взаимодействия между специалистами лаборатории и клиницистами в вопросах назначения и интерпретации лабораторных тестов. В 2009 г. Рабочей группой по стандартизации исследования аутоАТ (Working Group on Harmonization of Autoantibody Tests) Международной федерации клинической химии и лабораторной медицины (International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine) в тесной кооперации с Институтом эталонных материалов и измерений (Institute for Reference Materials and Measurements) Объединенного исследовательского центра Европейской комиссии (Joint Research Centre of the European Commission) поставлена задача создания новых референтных материалов, в том числе на основе очищенных поликлональных фракций IgG, IgM и IgA или препаратов моноклональных АТ вместо образцов высокопозитивных сывороток больных САРЗ. Так, в настоящее время завершена валидация международных референтных материалов для определения aβ2-ГП I, анти-ПР3 и анти-МПО [14].

Особое внимание в последние годы уделяется методическим аспектам определения АНА - гетерогенной группы аутоАТ, реагирующих с различными компонентами ядра и цитоплазмы, которые являются основным серологическим маркером САРЗ. Согласно рекомендациям ACR и EULAR «золотым стандартом» и первичным скрининговым методом определения АНА в сыворотке крови является НРИФ с использованием в качестве субстрата клеток линии HЕp-2 (эпителиальные клетки рака гортани человека) - НРИФ-HЕp-2 [25]. Применение стандартизованных клеток HEp-2 или варианта этой клеточной линии HEp-2000, имеющего большее количество митозов, позволяет существенно повысить чувствительность метода и достоверно описать различные типы свечения ядра. При двухэтапной стратегии иммунодиагностики САРЗ пациентам с положительными результатами обнаружения АНА методом НРИФ-HEp-2 рекомендуется проведение подтверждающих тестов для выявления специфических АТ к отдельным ядерным антигенам (анти-дсДНК, АТ к экстрагируемым ядерным антигенам) с помощью ИФА, иммуноблота и др. [11, 14, 24].

В последние годы в практике клинико-диагностических лабораторий широкое распространение получили скрининговые методы определения АНА на основе ИФА и мультиплексных биоаналитических технологий. По мнению экспертов EULAR и ACR, новые методы твердофазного анализа не могут заменить первичный скрининг АНА с помощью НРИФ-HЕp-2, так как идентифицируют АТ к ограниченному количеству очищенных/рекомбинантных антигенов или смеси антигенов (ядерному гомогенату) с измененными либо утраченными эпитопами, а это приводит к увеличению числа ложноотрицательных результатов. Международными рекомендациями 2013 г. допускается применение новых иммунометрических методов для одноэтапного скрининга и тестирования АНА при условии обязательного проведения повторного исследования АНА с помощью НРИФ-HЕp-2 в случае расхождении результатов измерения АНА с клиническими данными [24].

Следует отметить, что обычная техника флюоресцентной микроскопии имеет ряд ограничений, к которым относятся методические различия (тип микроскопа, используемые тест-системы и реагенты, длительность инкубации и др.), субъективная характеристика титра и типа свечения, необходимость длительного обучения персонала, отсутствие квалифицированной экспертной оценки результатов исследования. Все это приводит к значительной внутри- и межлабораторной вариабельности полученных данных. Разработка автоматизированных систем интерпретации клеточных флюоресцентных тестов создает предпосылки для стандартизации и улучшения воспроизводимости НРИФ при определении АНА и других аутоАТ (АНЦА, анти-дсДНК с использованием Crithidia luci­liae) у больных САРЗ [26].

Нами проведено исследование АНА в сыворотках 1178 больных ревматическими заболеваниями методом НРИФ-НЕр-2 с помощью коммерческого набора реагентов AKLIDES ANA («Medipan GmbH», Германия). Обработку результатов НРИФ-HЕp-2 проводили с использованием автоматизированной платформы AKLIDES («Medipan GmbH», Германия) на основе многопараметрического анализа внутриклеточных структур и путем визуальной оценки образцов флюоресценции под микроскопом AXIOSKOP 40 («Zeiss», Германия). Степень согласованности позитивных/негативных результатов обнаружения (x=0,5), типов (x=0,7) и титров/интенсивности свечения (x=0,45) АНА при автоматизированной и традиционной интерпретации НРИФ-HEp-2 являлась «хорошей». Таким образом, в повседневной практике автоматизированная платформа AKLIDES позволяет объективно и быстро идентифицировать позитивные и негативные результаты определения АНА сопоставимо с «классическим» визуальным методом интерпретации НРИФ-HEp-2, а также прогнозировать максимальный конечный титр АНА в сыворотках больных ревматическими заболеваниями по интенсивности сигнала флюоресценции.

Развитие протеомных технологий и накопление информации об особенностях профиля белков при РА стали предпосылками для создания комплексных диагностических индексов, основанных на многопараметрическом анализе лабораторных биомаркеров (In Vitro Diagnostic Multivariate Index Assay - МДИ). Среди МДИ большое клиническое значение имеет мультибиомаркерный индекс активности РА (multi-biomarker disease activity score - MBDA) (Vectra DA, «Crescendo Bioscience», США) [13, 27]. Многостадийный анализ и валидация 136 протеомных маркеров позволили выбрать 12 белков, играющих ключевую роль в патогенезе РА и имеющих наиболее высокую степень связи со значениями индекса DAS28-СРБ и его компонентов (число болезненных и припухших суставов, оценка общего состояния здоровья пациентом). В состав MBDА вошли молекула 1-го типа адгезии сосудистых клеток, эпидермальный фактор роста, фактор роста эндотелия сосудов, интерлейкин (ИЛ) 6, растворимый рецептор фактора некроза опухоли (ФНО) 1-го типа, матриксная металлопротеиназа 1-го и 3-го типов, хрящевой гликопротеин-39, лептин, резистин, С-реактивный белок (СРБ) и сывороточный амилоидный белок А. В настоящее время MBDA (Vectra DA) является единственным клинически апробированным многопараметрическим лабораторным индексом, применяемым для оценки активности, прогнозирования степени прогрессирования деструктивного поражения суставов и мониторинга эффективности терапии при РА. Установлена достоверная корреляция значений Vectra DA с динамикой индексов активности DAS28-СОЭ, DAS28-СРБ, CDAI, SDAI и прогрессированием деструкции суставов у больных РА, получавших терапию метотрексатом, ГИБП (ингибиторы ФНО, тоцилизумаб) и ингибитором JAK-киназы тофацитинибом [13].

На основании многофакторного анализа 30 биомаркеров в сыворотках больных РА (IgM, РФ, АТ к циклическому цитруллинированному пептиду - АЦЦП, АТ к модифицированному цитруллинированному виментину - АМЦВ, СРБ и 26 цитокинов), для определения которых использовались мультиплексный анализ на микрочастицах хМАР, ИФА и иммунонефелометрия, нами выделены лабораторные биомаркеры, наиболее тесно связанные с высокой/умеренной активностью РА по DAS28 (фактор роста фибробластов - FGF, белок-хемоаттрактант моноцитов, ИЛ-1β, ИЛ-6, ИЛ-15, ФНО), и создана прогностическая модель оценки активности РА [28]. По данным ROC-анализа, эта модель обладает отличной диагностической эффективностью при дифференциации высокой/средней активности РА от низкой (площадь под характеристической кривой 0,94 при 95% доверительном интервале от 0,88 до 1,0). На основе определения концентрации 36 биомаркеров в сыворотке крови (аутоАТ: IgM/IgA РФ, АЦЦП, АМЦВ; белков острой фазы воспаления: СРБ, кальпротектин; маркеров метаболизма костной и хрящевой ткани: COMP - олигомерный матриксный белок хряща, sRANKL - растворимый лиганд рецептора активатора ядерного фактора xВ; 27 цитокинов, хемокинов и факторов роста) при помощи технологии хMAP, ИФА и иммунонефелометрии с последующим многофакторным анализом полученных данных нами разработан кандидатный МДИ для прогнозирования раннего РА (МИРРА), включающий ИЛ-6, СРБ, гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор, интерферон-γ, его индуцибельный белок и АЦЦП. При диагностике раннего РА МИРРА обладает высокими чувствительностью и специфичностью (97 и 94% соответственно), превосходя IgM РФ (59 и 79%) по обоим параметрам, а АЦЦП (71 и 97%) по чувствительности. После тщательной клинической валидации разработанные нами многопараметрические лабораторные индексы могут рассматриваться как высокоинформативные методы ранней диагностики и оценки активности РА.

Таким образом, прогресс лабораторной диагностики САРЗ обусловлен все более широким внедрением в клиническую практику новых высокопроизводительных методов иммунного анализа с использованием автоматизированных систем и мультиплексных протеомных технологий. Актуальной проблемой лабораторной диагностики САРЗ является стандартизация современных методов выявления аутоАТ, в том числе создание международных референтных материалов для калибровки и внешней оценки качества иммунологических тестов. Применение комплексных диагностических индексов, основанных на многопараметрическом анализе лабораторных биомаркеров в сыворотке крови, позволяет наиболее полно и объективно оценить сложные молекулярные механизмы патогенеза САРЗ и тем самым радикально улучшить раннюю диагностику, оценку активности и тяжести заболевания, прогнозирование исходов патологического процесса и ответа на лечение.