Оценка эффективности схем диагностики энтерогеморрагического эшерихиоза. Этиологическая верификация гемолитико-уремического синдрома в Российской Федерации

Энтерогеморрагические Escherichia coli (EHEC) - одна из 6 описанных в настоящее время групп диарогенных E. coli. Критерием принадлежности к данной группе служит способность изолята E. coli к продукции шигоподобного токсина (веротоксина) 1-го и/или 2-го типов. Данная группа диарогенных E. coli иногда обозначается в литературе как «шиготоксинпродуцирующие» E. coli (STEC) или «веротоксинпродуцирующие» E. coli (VTEC). Способность к продукции шигоподобных токсинов определяется умеренным фагом и может быть присуща широкому спектру серогрупп и серотипов E. coli. Серотип О157:Н7 является частным случаем ЕНЕС, на долю которого в настоящее время приходится менее 50% случаев инфекций ЕНЕС [1, 2].

ЕНЕС ассоциированы с большим количеством спорадических и групповых случаев диарейных заболеваний, в части случаев осложняющихся развитием гемолитической анемии (ГА) и гемолитико-уремического синдрома (ГУС) [3, 4].

Естественным резервуаром ЕНЕС служат крупный и мелкий рогатый скот, свиньи и реже другие животные, у которых может наблюдаться бессимптомное носительство данного патогена в кишечнике. Наиболее распространенными факторами передачи являются сырое или недостаточно термически обработанное мясо, молоко и вторично контаминированные продукты питания, находившиеся с ними в контакте. С учетом низкой инфицирующей дозы больные также могут представлять потенциальную опасность для окружающих, но их эпидемиологическое значение существенно ниже. Группы риска манифестной инфекции ЕНЕС - дети младшего возраста и лица, чья деятельность связана с производством, транспортировкой и реализацией сырых мясных продуктов [5].

Особенность клинического течения инфекции ЕНЕС заключается в потенциальном риске развития осложнений в виде ГА, тромбоцитопении и ГУС, развивающегося на фоне или в пределах 10 дней после острой фазы заболевания, наиболее часто (90-95%) протекающей в форме гемоколита. ГУС развивается у 5-20% пациентов с инфекцией ЕНЕС и может приводить к необратимому нарушению функций почек. Более высокий риск развития осложненного течения характерен для детей младше 5 лет и пожилых людей [6].

При этом следует отметить, что, несмотря на полиэтиологичность ГУС, его развитие в рамках осложненного течения инфекции ЕНЕС является наиболее распространенным [7].

Лабораторные методы исследований преследуют несколько взаимосвязанных целей в надзоре за ЕНЕС:

- диагностика инфекции ЕНЕС в клинической практике проводится по их специфическим маркерам - шигоподобным токсинам или генам, кодирующим их синтез. При ранней этиологической диагностике ассоциированных с ЕНЕС гемоколитов возможна коррекция лечения пациентов для снижения риска развития ГУС как инвалидизирующего осложнения [7];

- диагностика инфекции ЕНЕС в рамках осуществления эпидемиологических исследований всегда требует характеристики изолята EHEC, выделенного в чистой культуре. Достижение данной цели базируется на результатах диагностики инфекции ЕНЕС в клинической практике и дополняется лабораторными методами подвидовой характеристики возбудителя, позволяющими верифицировать потенциально взаимосвязанные случаи заболеваний;

- выявление ЕНЕС в объектах окружающей среды, в частности в продуктах питания, проводится для оценки безопасности продукта и подтверждения эпидемиологической гипотезы о его роли в развитии выявленных заболеваний, что также требует изоляции чистой культуры возбудителя.

Целью данной работы явилась оценка практической эффективности алгоритмов диагностики энтерогеморрагического эшерихиоза, отраженных в нормативных документах, которые действуют на территории Российской Федерации. В рамках работы проведена оценка следующих показателей:

- распространенности инфекции ЕНЕС среди детей с симптоматикой острых кишечных инфекций (ОКИ);

- распространенности ГУС в анамнезе детей младше 5 лет с развитием летальных исходов на фоне перенесенных диарейных заболеваний;

- эффективности применения методов амплификации нуклеиновых кислот и бактериологических исследований для выявления генетических маркеров ЕНЕС (stx I/II) или изоляции культуры патогена в острой стадии инфекции ЕНЕС и у пациентов с ГУС.

Проведен сравнительный анализ документов, регламентирующих надзор за ЕНЕС в Российской Федерации и других государствах.

В работе исследовались следующие образцы:

- архивные образцы клинического материала (фекалии) от пациентов с ОКИ, госпитализированных в стационары Москвы в период с 2008 по 2011 г. (образцы сохранялись в условиях низкотемпературной заморозки (–68-70 °С));

- образцы от пациентов с ГУС/острой почечной недостаточностью (ОПН), ассоциированной с диарейным синдромом (образцы исследовались через несколько часов после сбора и не подвергались заморозке);

- образцы аутопсийного материала от пациентов младше 5 лет с развитием летальных исходов на фоне (или непосредственно после) перенесенных острых диарейных заболеваний.

Детекцию ЕНЕС осуществляли с использованием наборов реагентов РИБО-преп №ФСР 2008/03147 и АмплиСенс Эшерихиозы-FL №ФСР 2010/07977 в соответствии с инструкцией производителя (ФБУН «ЦНИИ эпидемиологии», РФ). Бактериологическое исследование образцов проводили в период с 01.01. по 01.06.11 с использованием среды обогащения (бульон, Мак-Конки) с последующим высевом на содержащие сорбитол среды (sorbitol-MacConkey agar - SMAC), в соответствии с рекомендациями Центра по контролю и профилактике заболеваний (CDC, США) [8]. Тестирование как позитивных, так и негативных по сорбитолу колоний в количестве от 60 до 77 с каждого образца фекалий проводили c применением пулирования по методике, представленной на сайте www.epid-oki.ru - «Рекомендации РЦКИ: Лабораторная диагностика ЕНЕС инфекции» [9].

При исследовании архивных образцов клинического материала от 2169 пациентов с ОКИ выявлена ДНК ЕНЕС в 27 (1,2%) случаях. Бактериологическое исследование поз­волило получить культуру ЕНЕС только в 13 (48,1%) случаях, несмотря на длительное хранение образцов в условиях низкотемпературной заморозки.

При исследовании клинического материала от 33 пациентов на стадии развития ГУС выявлена ДНК ЕНЕС у 12 с последующим выделением культур микроорганизма только в 2 случаях. Одна культура не уточнена, другая - О78:Н4. При анализе 25 случаев летальных исходов на фоне диарейных заболеваний у детей младшего возраста в период 2012-2013 гг., у 5 пациентов имелись анамнестические указания на развитие ГУС/ОПН. По данным литературы, наиболее вероятной причиной такого рода осложнений после перенесенного диарейного заболевания являются ЕНЕС. Один пациент умер на 2-й день заболевания на фоне инфекционно-токсического шока (ИТШ). Сроки развития летальных исходов у других 4 пациентов наблюдались на 5, 13, 38 и 51-й дни заболевания. ДНК ЕНЕС и культура микроорганизма выявлены только в 1 случае - в аутоптатах от пациента, умершего на фоне ИТШ в острой фазе заболевания. Результаты исследования представлены в таблице.

Сравнительный анализ документов, регламентирующих лабораторную диагностику ЕНЕС в РФ (МУК 4.2.2963-11 «Методические указания по лабораторной диагностике заболеваний, вызываемых E. coli, продуцирующих шига-токсины, (STEC-культуры), и обнаружению возбудителей STEC-инфекций в пищевых продуктах»), и других государствах (MMWR - Recommendations for Diagnosis of Shiga Toxin-Producing Escherichia coli Infections by Clinical Laboratories [8]; Guidance for Public Health Laboratories: Isolation and Characterization of Shiga toxin-producing Esherichia coli (STEC) from Clinical Specimens [10]) выявил ключевые различия.

А. Различия в показаниях к обследованию

В МУК 4.2.2963-11 представлены 3 показания к обследованию:

1) наличие у пациента ГУС после (на фоне) перенесенного диарейного заболевания;

2) наличие у пациента ГА после (на фоне) перенесенного диарейного заболевания;

3) наличие у пациента любого (по тяжести и синдромальному диагнозу) диарейного заболевания при наличии эпидемиологических данных о возможной связи заболевания с EHEC.

В рекомендациях Центра по контролю и профилактике заболеваний (CDC, США) показания к проведению лабораторных исследований на ЕНЕС сформулированы иначе: «Все образцы фекалий от пациентов с внебольничными диареями, предназначенные для исследования на Shigella spp., Salmonella spp. и Campylobacter spp., должны исследоваться с применением селективных или дифференциальных сред для выявления О157:Н7. Данные образцы должны одновременно тестироваться на наличие других групп ЕНЕС с применением тестов для выявления шигоподобных токсинов или их генов».

Б. Различия в рекомендуемых алгоритмах проведения лабораторных исследований

В рекомендациях CDC представлен единый логичный алгоритм бактериологических исследований, основанный на возможности использования универсальных сред для высева О157:Н7 и ЕНЕС других серогрупп. В оте­чественных МУ представлены 3 (!) раздельных алгоритма для изоляции культур О157:Н7, О104:Н4 и ЕНЕС других серогрупп. Причем различия между данными алгоритмами начинаются с этапа выбора сред для первичного посева образцов (О157:Н7 - сорбитол-агар, О104:Н4 - Мак-Конки агар и среда Левина, прочие ЕНЕС - среда Эндо). Однако определение серогрупповой/типовой принадлежности изолята является финальной частью исследования и методология выбора серотипоспецифичного алгоритма в его начале остается загадкой.

Таким образом, в зарубежных документах делается упор на выявление ЕНЕС при обычном скрининге клинического материала в лабораториях, в отечественных - на работу с клиническим материалом в рамках выявленного очага групповой заболеваемости с установленной этиологией.

Отдельную проблему, которая ограничивает возможности эффективного мониторинга циркуляции ЕНЕС, представляют юридические ограничения возможности проведения бактериологической диагностики в лабораториях лечебно-профилактических учреждений (ЛПУ), связанные с отнесением ЕНЕС ко 2-й группе ПБА (постановление Главного государственного санитарного врача РФ, №86 от 29 июня 2011 г.).

Таким образом, методологические трудности надзора за ЕНЕС связаны с ограничениями по проведению бактериологической диагностики в лабораториях ЛПУ, рекомендациями по проведению обследования лиц не в острой стадии заболевания, а на поздних стадиях развития ГУС/ОПН и рекомендуемыми нелогичными алгоритмами работы.

На основании изложенной информации мы можем сделать следующие выводы. На территории Москвы наблюдается закономерная циркуляция ЕНЕС среди детского населения с частотой выявления около 1,2% от общего числа детей, госпитализируемых с ОКИ.

Случаи летальных исходов заболеваний у детей на фоне предполагаемой (или лабораторно подтвержденной) инфекции ЕНЕС составляют достаточно большую часть от общего числа (4 из 25). Причем чаще наблюдаются на поздних стадиях заболевания, что затрудняет их этиологическую верификацию.

Эффективность бактериологической диагностики инфекции ЕНЕС на острой стадии заболевания существенно выше (13 из 27), чем на стадии развития ГУС/ОПН (2 из 33).

Действующая в Российской Федерации нормативная документация не позволяет проводить эффективный надзор за циркуляцией ЕНЕС и нуждается в пересмотре.