ККМ — клетки костного мозга

КМ — костный мозг

МСК — мезенхимальные стромальные клетки

ОМЛ — острый миелоидный лейкоз

РА — рефрактерная анемия

РАИБ — рефрактерная анемия с избытком бластов

РАКС — рефрактерная анемия с кольцевыми сидеробластами

FISH — флюоресцентная in situ гибридизация

Оценка цитогенетических аномалий в костном мозге (КМ) у больных с миелодиспластическим синдромом (МДС) имеет большое значение для подтверждения клональной природы заболевания, определения прогноза заболевания и выбора тактики лечения больных. Цитогенетические аномалии в клетках костного мозга (ККМ) выявляют у 40—70% пациентов с МДС, и их разнообразие характеризует заболевание. Так, изолированная делеция (5q) выявляется у пациентов с отдельной нозологической формой МДС, 5q-синдромом, характеризующейся своеобразной клинической картиной, хорошим ответом на иммуномодулирующую терапию и благоприятным прогнозом. Изолированная трисомия 8 позволяет отнести пациента к группе промежуточного риска и является прогностическим фактором эффективности иммуносупрессивной терапии. Аномалии 7-й хромосомы (моносомия или делеция q-плеча) определяют крайне неблагоприятный прогноз и диктуют необходимость выбора агрессивной тактики лечения, в том числе выполнения трансплантации аллогенных гемопоэтических стволовых клеток в качестве первой линии терапии. Комплексные хромосомные аномалии (3 и более) могут включать –5/del(5q), –7/del(7q), del(17p) и чаще всего ассоциируются с вторичным МДС и неблагоприятным течением заболевания. Разнообразие выявляемых генетических аномалий при МДС представлено в табл. 1 [1].

Клиническое течение МДС различно и зависит от варианта заболевания. Рефрактерные цитопении (рефрактерная анемия — РА, рефрактерная тромбоцитопения, рефрактерная нейтропения), как правило, имеют благоприятный прогноз. При увеличении количества бластных клеток в КМ (варианты РА с избытком бластов — РАИБ-1 и РАИБ-2) вероятность трансформации в острый лейкоз увеличивается, и при определении более 20% бластных клеток диагностируют острый миелоидный лейкоз (ОМЛ) с предшествующей миелодисплазией [1—5].

Развитие МДС обусловлено клональным повреждением стволовой кроветворной клетки. Происходит ли это нарушение на уровне истинно стволовой клетки или коммитированных миелоидных предшественников, остается неясным. В последние годы в литературе опубликованы данные о выявлении хромосомных аберраций в популяции гемопоэтических клеток—предшественниц CD34+ у пациентов с МДС и ОМЛ [6—10]. Указывается также на определение патологического клона не только среди миелоидных клеточных линий, но и лимфоидных [11—13], что может быть обусловлено повреждением мультипотентной стволовой клетки.

Кроветворение в КМ обеспечивается постоянным взаимодействием гемопоэтических клеток-предшественниц и клеток стромального микроокружения. Мезенхимальные стромальные клетки (МСК) являются главным компонентом микроокружения и удобной моделью для изучения in vitro. В последнее время опубликованы работы о нарушенной функции стромы при МДС, в частности нарушен механизм миграции гемопоэтических клеток-предшественниц в костномозговые ниши. При сочетанном культивировании гемопоэтических и стромальных предшественников показано, что МСК, полученные от больных с МДС, демонстрируют сниженную способность к поддержанию нормальных гемопоэтических предшественников, у них существенно снижена пластичность по сравнению с таковой у МСК, полученных из КМ здоровых лиц, что может обусловливать неэффективный гемопоэз при МДС [11, 14—18].

Рядом исследовательских групп получены данные, согласно которым в МСК не определяются характерные для МДС хромосомные аберрации, и было сделано предположение, что строма не вовлечена в клональный процесс при данном заболевании и кариотип МСК не изменен [19—21]. Однако в работах E. Flores-Figueroa и соавт. [22, 23], O. Blau и соавт. [24, 25] показано наличие хромосомных нарушений в МСК, в том числе клональных, у отдельных пациентов с МДС. Исследование экспрессии генов с помощью микрочипов демонстрирует наличие генетических аномалий МСК у пациентов с МДС, в частности с 5q-синдромом [26]. Кроме того, на непосредственное участие стромального микроокружения в развитии МДС указывают данные, полученные M. Raaijmakers и соавт. [27], об индуцированном появлении признаков дисплазии в кроветворных клетках мышей при специфическом повреждении стромы.

С учетом несомненной тесной взаимосвязи гемопоэтических и стромальных клеток-предшественниц при развитии МДС представляется важным изучение цитогенетических особенностей этих клеточных популяций у пациентов с МДС.

В работе представлены результаты обследования 35 первичных больных, полученные в момент диагностики, в период с июля 2011 г. по май 2012 г.: 29 больных, их которых с МДС (РА) — 4, с рефрактерная цитопенией с мультилинейной дисплазией (РЦМД) — 13, с рефрактерной анемией с кольцевыми сидеробластами (РАКС) — 2, с РАИБ — 7, с 5q-синдром — 3; 6 больных в стадии трансформации в ОМЛ (1 пациент с вторичным ОМЛ) и 7 здоровых доноров КМ. Диагноз устанавливали в соответствии с классификацией ВОЗ (2008) [1]. Соотношение мужчин и женщин 18/17. Медиана возраста составила 60 лет (19—77 лет).

Цитогенетическое исследование ККМ проводили прямым методом и после краткосрочного (16—24 ч) культивирования клеток. Фиксацию и приготовление препаратов хромосом выполняли по общепринятой методике. G-дифференциальную окраску хромосом (G-band) осуществляли по методике M. Seabright [28] в модификации с применением красителя Wright. Цитогенетическое исследование МСК выполняли по методу, описанному Z. Zhang и соавт. [29]. Хромосомный анализ проводили в соответствии с Международной цитогенетической номенклатурой хромосом человека (ISCN 2005) [30]. Анализировали в среднем 20 метафаз. Клональной считали аномалию при обнаружении структурной перестройки и трисомии минимум в 2 метафазах и моносомии минимум в 3. При обнаружении структурной перестройки в одной метафазе перестройку обозначали как неклональную (спонтанную). Единичные неполные митозы не учитывали ввиду возможности потерь хромосом при обработке клеточного осадка. Флюоресцентную in situ гибридизацию (FISH) выполняли на ККМ и изолированных клетках CD34+ с использованием набора ДНК-зондов LSI (5q33—q34) EGR-1 SpectrumOrange/D5S721/D5S23 SpectrumGreen Probe, LSI (7q31) SpectrumOrange/CEP 7 SpectrumGreen Probe, CEP 8 SpectrumOrange DNAProbeKit, LSIAML1/ETO Dual Color Fusion Translocation Probe, CEP X SpectrumOrange/CEPY SpectrumGreen DNA Probe, LSI D20S108 (20q12) SpectrumOrange Probe («Vysis Abbott», США). Гибридизацию осуществляли согласно методике фирмы-производителя. Анализ сигналов проводили под флюоресцентным микроскопом Zeiss-Axioscope с использованием тройного фильтра Orange/Green/Dapi. Анализировали 200 интерфазных ядер.

Гемопоэтические клетки—предшественницы СD34+ получали из КМ и периферической крови. Мононуклеарные клетки выделяли, центрифугируя в градиенте плотности фиколла, и метили CD34 MicroBeads human. Изолированную фракцию клеток CD34+ получали, используя MACS колонки для магнитной сепарации, в соответствии с инструкциями фирмы-производителя («Miltenyi Biotec», «Bergisch Gladbach», Германия). Чистота полученной фракции проверена с помощью проточной цитометрии и составила 94,5% (рис. 1).

Культуру МСК получали из КМ. Фракцию мононуклеаров выделяли из аспирата КМ в градиенте плотности фиколла (1,077 г/см³). Для получения МСК мононуклеары культивировали в пластиковых матрасах с площадью дна 25 и 75 см² в концентрации 1—6·10⁶ клеток на флакон в среде α-МЕМ («HyClone», США) с 10% эмбриональной телячьей сывороткой («HyClone», США), 2 мМ L-глутамина («BioWest»), 100 ед/мл пенициллина и 50 ед/мл стрептомицина («Ферейн», Россия). После образования конфлюэнтного монослоя из фибробластов клетки снимали 0,05% раствором трипсина и пассировали. В большинстве исследований использовали клетки после 2—3 пассажей.

Цитогенетическое исследование ККМ. Характеристика больных и результаты цитогенетического исследования КМ представлены в табл. 2.

Метод FISH на ККМ использовали у пациентов с выявленными аномалиями кариотипа для подтверждения этих аномалий. У пациентов с нормальным кариотипом или в отсутствие делящихся клеток выполняли FISH-исследование с ДНК-зондами к 5, 7 и 8-й хромосомам для выявления патологии в указанных хромосомах как наиболее значимых аномалий при МДС.

У 5 (14%) из 35 больных методом FISH выявлены скрытые хромосомные аномалии, которые не определены при кариотипировании: у 2 из них (МДС) при цитогенетическом исследовании не получены митозы и методом FISH выявлены хромосомные аномалии: в первом случае — одновременно del(5q) и del(7q) в 84% клеток, во втором — трисомия 8 в 67% клеток. Еще у 2 больных (ОМЛ у 1 и МДС у 1) методом G-band определен нормальный кариотип, однако с помощью метода FISH выявлена del(5q) в обоих случаях. У 1 больного МДС, у которого в кариотипе определена изолированная del(5q), FISH-анализ позволил выявить дополнительно трисомию 21 в 52% клеток (исследование выполнено прицельно, так как имелись анамнестические данные предыдущего цитогенетического анализа у этого пациента, выявившего 2 аномалии). Таким образом, после применения метода FISH дополнительно к исследованию кариотипа число больных с цитогенетическими аномалиями в ККМ увеличилось с 13 до 17 (49%).

FISH-исследование выделенных гемопоэтических клеток—предшественниц CD34+ из КМ и периферической крови. Методом FISH проанализированы гемопоэтические клетки—предшественницы CD34+, полученные из КМ и периферической крови, у 24 из 35 пациентов (у 3 ОМЛ, у 21 МДС). У 10 из 24 пациентов в КМ определены хромосомные аномалии. Мы подтверждали эти аномалии в популяции клеток CD34+ с помощью FISH-исследования.

В данной группе у всех обследованных пациентов в гемопоэтических клетках—предшественницах CD34+ были определены хромосомные аберрации. Среднее число ядер с патологическими флюоресцентными сигналами в общей популяции ККМ, ККМ и периферической крови CD34+ статистически значимо не различалось и составило 65,8, 73,1 и 74,8% соответственно (табл. 3).

Цитогенетическое исследование МСК. Кариологический анализ МСК выполнен у 23 из 35 пациентов (МДС у 19 и ОМЛ у 4) и у 7 здоровых доноров КМ (см. табл. 2). У 12 больных из 35 не удалось получить рост МСК в культуре вследствие ограниченной способности стромальных клеток больных с МДС к пролиферации. Нормальный кариотип МСК определен у всех больных ОМЛ и у 6 больных с МДС, у одного из которых в кариотипе МСК определена конституциональная инверсия inv(9). У 2 (11%) из 19 пациентов с МДС выявлены аномалии кариотипа.

У одного из них с конституциональной inv(9) (пациент №12) выявлена неклональная транслокация в одной метафазе: 46ХY,t(2;22)(p10;q11), inv(9)(p13q21)[1]/46ХY, inv(9) (p13q21)[19]. У второго (пациент №21) в кариотипе МСК выявлена клональная перестройка в 7 метафазах из 20: 46ХУ,add(2q)[7]/46ХУ[13]. В КМ у этого больного определен комплексный кариотип (рис. 2).

В настоящей работе представлен анализ цитогенетических изменений в популяциях гемопоэтических и стромальных клеток-предшественниц у пациентов с различными вариантами МДС, а также в стадии трансформации заболевания в ОМЛ. Интерес к изучению этой области определяется тем, что до сих пор остается неуточненным вопрос об истинном уровне генетического повреждения при МДС, а также участии стромального микроокружения в патогенезе клональной эволюции миелодисплазии.

Определение кариотипа ККМ в настоящее время входит в перечень стандартных исследований, необходимых для верификации диагноза МДС. Выявленные хромосомные аномалии определяют прогноз заболевания и соответственно тактику лечения больных. Современные прогностические шкалы, в частности шкала IPSS-R, помимо количества бластных клеток в КМ, степени цитопении и зависимости от гемотрансфузий, включают данные цитогенетического анализа [31]. В нашем исследовании цитогенетические аномалии в КМ обнаружены у 17 (49%) из 35 обследованных, что коррелирует с данными литературы [1—5]. Стоит еще раз отметить, что не во всех случаях метод стандартного цитогенетического исследования явился достаточным для обнаружения аномалий кариотипа, и у около 10% пациентов не удалось получить делящиеся клетки для анализа. По меньшей мере в 14% случаев (по нашим данным, у 5 из 35 больных) методом FISH могут быть выявлены дополнительные (скрытые) хромосомные аномалии. У всех 5 больных размер выявленных клонов был довольно велик (от 52 до 84%); такие клоны не могут быть незамеченными при хромосомном анализе. По-видимому, все эти клетки находятся в стадии G0, не выходят в митоз и поэтому не обнаруживаются при кариотипировании. У 1 из 5 пациентов с выявленной del(5q) неразделившиеся клетки содержали вторую аномалию — трисомию 21. Можно предположить, что у этого больного наблюдалось 2 клона клеток в КМ — один только с del(5q) и второй одновременно с del(5q) и трисомией 21. Выявление дополнительных хромосомных аномалий у ряда пациентов может иметь принципиальное значение, так как от этого зависят и прогноз заболевания, и терапевтический подход. Так, при определении нормального кариотипа в ККМ может быть выбрана тактика динамического наблюдения с последующими исследованиями КМ, тогда как выявление del(5q) позволяет эффективно применять иммуномодулирующую терапию. Следовательно, в дебюте заболевания всем пациентам целесообразно сначала проводить стандартное цитогенетическое исследование, и в случаях определения нормального кариотипа или отсутствия делящихся клеток необходимо выполнять FISH-исследование с целью определения клинически значимых хромосомных аномалий. Всем пациентам, не дожидаясь получения результатов кариотипирования, проводить FISH-исследование нецелесообразно [32].

В клетках CD34+, выделенных из КМ и периферической крови, определены те же клональные нарушения, что и в ККМ пациентов с аномалиями кариотипа, что подтверждает поражение гемопоэтических предшественников при МДС. По данным литературы, количество клеток—предшественниц CD34+ в КМ больных МДС значительно больше, чем у здоровых лиц, пациентов с апластической анемией и вторичными цитопеническими синдромами. Процент клеток CD34+ неоднороден у пациентов категорий низкого (1,7%) и высокого (10,5%) риска и максимальный у пациентов с ОМЛ (35%), он коррелирует с процентом бластных клеток и немного превышает его [33]. Количество циркулирующих клеток CD34+ у пациентов с МДС также значительно больше, чем у здоровых лиц, и зависит от процентного содержания их в КМ [34]. Наряду с увеличением количества бластных клеток, увеличение количества клеток CD34+ тоже может свидетельствовать о прогрессии заболевания. В нашем исследовании выявлено, что в среднем процент клонально измененных клеток среди гемопоэтических предшественников не отличается от такового в общей популяции ККМ пациентов с аномалиями кариотипа. Однако у 4 из 10 больных отличия выявлены. Согласно нашим наблюдениям размер патологического клона в клетках CD34+ может быть как значительно больше, так и меньше размера клона в общей популяции ККМ. Возможно, выраженность клональных изменений в гемопоэтических клетках-предшественницах может свидетельствовать о динамике развития заболевания и иметь прогностическое значение. Ввиду того что результаты FISH-исследования циркулирующих клеток СD34+ в среднем сопоставимы с результатами исследования ККМ, цитогенетический контроль динамики заболевания в процессе лечения при наличии маркеров для FISH-исследования может осуществляться с использованием изолированной фракции клеток CD34+ или мононуклеарной фракции периферической крови, что поможет снизить кратность пункций КМ у пациентов с МДС. У пациентов с нормальным кариотипом хромосомные перестройки не обнаружены и в популяции клеток CD34+. Таким образом, детальное цитогенетическое исследование (стандартное цитогенетическое исследование и FISH) не выявило у пациентов с нормальным кариотипом в КМ «скрытых» хромосомных аномалий в гемопоэтических предшественниках CD34+.

Почти у 90% пациентов с МДС и у всех пациентов с ОМЛ в нашем исследовании определен нормальный кариотип МСК. Хромосомные аномалии МСК выявлены у 2 (11%) из 19 пациентов с МДС. У обоих выявлены структурные аномалии: у одного — 35% клон add(2q), у другого — с конституциональной хромосомной нестабильностью, inv(9)(p13;q21) — единичный митоз с t(2;22)(p10;q11). Учитывая, что у пациента с клональными изменениями кариотипа МСК в ККМ обнаружен комплексный кариотип, можно предположить, что генетическая нестабильность стромы обусловлена множественными цитогенетическими аномалиями в кроветворных клетках. Численные аномалии кариотипа МСК не выявлены ни в одном случае.

Как упоминалось выше, в литературе есть публикации, согласно которым хромосомные аномалии в МСК у пациентов с МДС не определяются [19, 20]. По-видимому, причина заключается в использовании разных методов цитогенетического анализа, так как авторы с целью определения аномалий кариотипа МСК применяли только FISH-исследование с выявленными в ККМ цитогенетическими маркерами и не исследовали кариотип МСК, тогда как выявленные нами аномалии МСК определяются только при кариотипировании. Таким образом, в МСК у пациентов с МДС, действительно, не определяются характерные для ККМ цитогенетические аномалии, однако возможны отличные от них аберрации. В работах E. Flores-Figueroa и соавт. [22, 23] и Lu-Xi Song и соавт. [35] описаны аномалии кариотипа МСК более чем у 50% обследованных пациентов с МДС, в основном за счет неклональных потерь отдельных хромосом. Однако встречающиеся отдельные неполные митозы нами не учитывались, так как подобные ситуации могут встречаться вследствие технических особенностей обработки клеточного осадка. O. Blau и соавт. [25] описывают клональные структурные аномалии МСК у 16% пациентов с МДС и ОМЛ. Результаты нашего исследования сопоставимы с результатами O. Blau, однако мы не выявили аномалии кариотипа МСК у пациентов в стадии трансформации МДС в ОМЛ.

Таким образом, несмотря на небольшое число проанализированных больных, на основании проведенного исследования можно сделать заключение, что в гемопоэтических и мезенхимальных клетках-предшественницах у пациентов с МДС определяются разные цитогенетические аномалии. В клетках CD34+, выделенных из КМ и периферической крови, выявлены те же аномалии, что и в общей популяции ККМ. У 11% пациентов с МДС выявлены аномалии кариотипа МСК, что указывает на генетическую нестабильность стромы при этом заболевании и подверженность возникновению хромосомных поломок. Различия хромосомных аномалий, определяемых в гемопоэтических и мезенхимальных клетках-предшественницах, подтверждают, что клетки стромального микроокружения в отличие от гемопоэтических предшественников не являются частью патологического клона при МДС, однако, вероятно, играют важную роль в патогенезе развития заболевания.