КМ — костный мозг

ММ — множественная миелома

ПЦР-ОТ — полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией

ФРЭС — фактор роста эндотелия сосудов

Изучение опухолевого ангиогенеза при множественной миеломе (ММ) важно для понимания особенностей патогенеза опухолевого роста, клинических проявлений болезни, ее диагностики и ответа на цитостатическую терапию. Этот вопрос был поставлен ранее в исследованиях, касающихся солидных опухолей [1—4]. Была сформулирована гипотеза о том, что жизнеспособность микрокластеров опухолевых клеток может обеспечиваться ростовыми факторами микроокружения [5—7]. Однако дальнейший рост опухоли невозможен без формирования опухолевой сосудистой сети [8—11]. В связи с этим при ММ, относящейся к злокачественным системным В-клеточным лимфопролиферативным процессам, некоторые клинические проявления могут быть уточнены при изучении ангиогенной активности опухолевых плазмоцитов [12—14]. Основанием для этого служат клинические данные, указывающие на неоднородный характер опухолевого роста при ММ. У 30% больных ММ за счет экстрадурального роста крупного миеломного узла возникает такой тяжелый клинический синдром, как опухолевая компрессия спинного мозга [15, 16]. Появление видимых опухолей при ММ является закономерным признаком болезни, который может служить критерием эффективной терапии при его уменьшении после лечения [17]. Очаги остеолиза, связанные с узловым типом роста в костном мозге (КМ), также являются признаком болезни и служат одним из критериев для определения ее стадии [18]. Встречаются также формы ММ с диффузным типом опухолевого роста [19]. Это различие клинических вариантов болезни может быть обусловлено изменениями активности ангиогенеза. Результаты исследований свидетельствуют о различной активности генов ангиогенеза при ММ и моноклональной гаммапатии неясного генеза (MGUS), коррелирующей с различными величинами плотности сосудов КМ по данным иммуногистохимического исследования трепанобиоптатов КМ [20, 21]. Актуальность данной проблемы подтверждается еще и тем, что исследования ангиогенеза в солидных опухолях послужили основанием для создания лекарственных препаратов, блокирующих его в опухолевых клетках, которые теперь используют в клинической практике в сочетании с противоопухолевыми препаратами. Современные антиангиогенные препараты целенаправленного действия («таргетные») могут быть эффективны и у больных ММ с активным ангиогенезом [22].

Цель исследования: установить значение активности ангиогенеза, оцениваемой по экспрессии генов факторов роста эндотелия сосудов (ФРЭС) VEGF-A, VEGF-C и VEGF-D и их рецепторов VEGFR1, VEGFR1s, VEGFR2, VEGFR3 в мононуклеарной фракции аспиратов КМ с преобладанием опухолевых плазматических клеток при различных вариантах течения ММ.

В исследование включили 33 больных (14 мужчин, 19 женщин в возрасте от 37 до 75 лет) с ММ ІІІ стадии. Диагноз устанавливали на основании жалоб больных (боли в костях различной интенсивности, в поясничном отделе позвоночника, обусловленные корешковым синдромом). Видимые опухоли имелись у 3 больных. Диагноз подтверждали результатами цитологических исследований аспиратов КМ, в которых выявлялась плазмоклеточная инфильтрация. Всем больным проводили рентгенографию костей скелета в двух проекциях. Генерализованный остеолитический синдром диагностирован у 24 из 33 больных. У 8 пациентов с упорными корешковыми болями выявлен внутриспинальный опухолевый рост без симптомов компрессии спинного мозга (по данным магнитно-резонансной томографии позвоночника). Иммунохимическое исследование белков сыворотки крови и мочи выполнили у 31 из 33 больных. Выявленная моноклональная секреция парапротеина распределилась следующим образом: Gk — у 15 больных, Gλ — у 4, GkBJk — у 4, GλBJλ — у 2, Ak — у 2, Aλ — у 2, Mk — у 1, BJλ — у 1. К началу настоящего исследования 23 пациента были первичными, 9 — резистентными к проводимой ранее цитостатической терапии, у одного зафиксирован рецидив. Индукционный период лечения включал от 6 до 8 курсов цитостатической терапии по протоколу М-2 (циклофосфан, мелфалан, винкристин, преднизолон, нитрозомочевина). Поддерживающую терапию проводили по протоколу М-2 1 раз в 3 мес. Лечение резистентных и рецидивных больных в дальнейшем проводили с помощью программ, содержащих велкейд, в одном наблюдении использовали ревлимид.

Выделение РНК из клеток КМ. После аспирации клетки костного мозга (ККМ) наслаивали на Ficoll и центрифугировали, после чего на границе раздела фаз отбирали мононуклеарную фракцию клеток ККМ, содержащую преимущественно плазматические клетки. К осадку клеток добавляли Trizol. Выделения РНК проводили согласно стандартному протоколу. Концентрацию РНК определяли спектрофотометрически по поглощению света при длине волны 260 нм. Электрофорез выделенной РНК проводили в 1% агарозном геле с добавлением бромида этидия. Качество выделенной РНК оценивали визуально по наличию полос рибосомальной РНК.

Полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией (ПЦР-ОТ). Экспрессию мРНК генов, кодирующих (ФРЭС) VEGF-A, VEGF-C, VEGF-D и рецепторы VEGFR1, VEGFR1s, VEGFR2 и VEGFR3 определяли методом ПЦР-ОТ на амплификаторе Терцик («ДНК-технология», Россия). Нуклеотидные последовательности использованных специфических праймеров приведены в таблице.

Цитологическая оценка аспиратов КМ больных ММ. При установлении диагноза проводили стандартную цитологическую оценку аспирата КМ, окрашенного по Романовскому (ув. 1000). Затем проводили расширенный анализ аспиратов КМ больных с подсчетом количества плазматических клеток, кластеров плазматических клеток (клеточная структура, содержащая от 3 плазматических клеток) и эндотелия сосудов (однослойный пласт эндотелиальных клеток, выстилающих участок кровеносного сосуда изнутри) в одном поле зрения (ув. 200). В каждом аспирате КМ произведен подсчет 50 полей зрения, что является репрезентативной выборкой. Для контроля клеточного состава проводили цитологическую оценку полученной мононуклеарной фракции КМ, которая содержала от 74,2 до 93,6% опухолевых плазматических клеток.

Оценка остеодеструктивного процесса в костях скелета больных ММ. Критерии оценки остеолиза разработаны в отделении клинической гематологии и иммунотерапии МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского. Для оценки выбирали 4 зоны: череп, ребра, позвоночник, таз. Остеолиз оценивали в баллах: отсутствие очагов остеолиза — 0 баллов, 1 или 2 очага в одной зоне — 1 балл, множественные (≥ очаги в одной зоне) и/или мягкотканевой — 2 балла.

Характеристику распространенности остеолитического процесса получали при суммировании баллов каждой из исследованных рентгенологических зон костной системы (в 2 проекциях). Минимальная оценка составляла 1 балл, максимальная — 8 баллов.

Статистическую обработку данных проводили определением достоверности методом непрямых разностей (Монцевичюте—Эрингене, 1964). Общую выживаемость больных оценивали с помощью теста Вилкоксона—Гехана. Различия считали достоверными при р<0,05.

При анализе экспрессии генов ФРЭС VEGF-A, VEGF-C, VEGF-D у больных ММ экспрессия гена ФРЭС VEGF-A выявлена у 24 (72,7%), ген VEGF-C был экспрессирован у 13 (39%), мРНК фактора роста VEGF-D — у 7(21,2%). Таким образом, мРНК основного ФРЭС VEGF-A имелась у большинства больных.

При анализе результатов экспрессии генов рецепторов ФРЭС VEGFR1, VEGFR1s, VEGFR2, VEGFR3 экспрессия гена рецептора VEGFR1 была выявлена у 25 (75,7%) больных, ген растворимой формы рецептора VEGFR1s — у 27 (81,8%), экспрессия гена VEGFR2 — у 3 (9%), экспрессия гена рецептора VEGFR3 — у 25 (75,7%). Таким образом, экспрессия генов рецепторов VEGFR1, VEGFR1s и VEGFR3 выявлена у большинства больных ММ, а экспрессия гена рецептора VEGFR2 встречалась редко.

Представляло интерес проанализировать коэкспрессию генов ФРЭС VEGF-A,VEGF-C,VEGF-D. У 8 (24,2%) больных экспрессия генов ФРЭС не отмечена, ген одного из факторов VEGF был экспрессирован у 8 (24,2%) пациентов, гены 2 факторов VEGF — у 14 (42,4%), у 3 (9%) обнаружена экспрессия генов 3 ФРЭС.

Исходя из полученных результатов можно сделать заключение о достаточно высокой частоте экспрессии генов ФРЭС при ММ: у 51,4% больных обнаружена коэкспрессия 2 или 3 генов исследованных ФРЭС. При изучении коэкспрессии генов рецепторов ФРЭС установлено, что гены VEGFR экспрессированы или коэкспрессированы у всех 33 пациентов. Ген одного из рецепторов экспрессирован у 5 (15,1%) больных, гены 2 рецепторов — у 9 (27,3%), 3 рецепторов — у 17 (51,5%) и 4 рецепторов — у 2 (6%).

Высокая частота экспрессии генов рецепторов ФРЭС VEGFR свидетельствует о том, что опухолевые плазматические клетки, преимущественно содержащиеся в мононуклеарной фракции аспиратов КМ больных ММ, способны отвечать на сигналы факторов роста VEGF, секретируемых либо клетками стромы микроокружения, либо самими плазматическими клетками, тем самым поддерживая активность опухолевого роста.

Исходя из анализа экспрессии и коэкспрессии генов ФРЭС VEGF-A, VEGF-C, VEGF-D и их рецепторов VEGFR1, VEGFR1s, VEGFR2, VEGFR3 создавались предпосылки для разделения больных на группы по наличию или отсутствию экспрессии. В результате мы выделили 2 группы: 24 (72,7%) больных с наличием и/или высокой экспрессией генов («васкулярный» тип) и 9 (27,3%) — с низкой и/или отсутствующей экспрессией («аваскулярный» тип). При этом в «аваскулярной» группе у всех 9 больных ММ отсутствовала экспрессия гена фактора роста VEGF-A, который является одним из основных факторов ангиогенеза. Экспрессия гена VEGF-C выявлена только у 1 больного этой группы. У этих же больных экспрессия гена фактора VEGF-D не определялась. В то же время экспрессия гена рецептора VEGFR1 выявлена у 5 из 9 больных. Высокая частота экспрессии гена растворимой молекулы VEGFR1s встречалась у 6 больных из 9. мРНК гена рецептора VEGFR3 обнаружена у 5 больных из 9. При этом следует отметить полное отсутствие в данной группе больных экспрессии гена рецептора VEGFR2 — основного рецептора для VEGF-A.

Проведена оценка экспрессии генов в «васкулярной» группе из 24 (72,7%) больных с высокой экспрессией генов ФРЭС и их рецепторов.

У всех 24 больных этой группы выявлена экспрессия гена фактора VEGF-A — одного из основных факторов ангиогенеза. Экспрессия генов факторов VEGF-C и VEGF-D встречалась в этой группе с меньшей частотой (12 и 7 больных соответственно), причем выявлялись случаи коэкспрессии 2 и 3 факторов. Следует также отметить, что при этом варианте ММ была высокая частота экспрессии и коэкспрессии генов рецепторов VEGFR1, VEGFR1s и VEGFR3. Экспрессия гена рецептора VEGFR2 выявлена лишь у 3 из 24 больных.

На основании полученных нами данных составлена логическая модель ангиогенеза при ММ. Опухолевая плазматическая клетка в большинстве случаев характеризуется активной функцией генов ФРЭС, включая ген, кодирующий один из основных ангиогенных факторов, — VEGF-A. В результате активной функции гена синтезированный фактор выделяется в окружающую среду, где взаимодействует со своим рецептором VEGFR2, который представлен на эндотелии сосудов микроокружения, что стимулирует образование новых сосудов вокруг плазматической клетки. Подобный рецептор практически не синтезируется на опухолевой плазматической клетке, что подтверждается нашими исследованиями, которые выявили активность этого гена лишь у 9% больных. Это обстоятельство имеет большое биологическое значение, которое заключается в том, что взаимодействие VEGF-A со своими рецепторами не будет блокироваться опухолевой клеткой.

Кроме указанного главного механизма стимуляции ангиогенеза опухолевыми миеломными клетками, осуществляемого при взаимодействии VEGF-A с VEGFR2, существуют дополнительные механизмы, которые могут усиливать или подавлять ангиогенное воздействие опухолевой клетки на эндотелий сосудов. К дополнительным факторам, усиливающим ангиогенез, следует отнести VEGF-D, который экспрессировался при ММ у 21,2% больных. Как показали опубликованные исследования, фактор VEGF-D обладает возможностью стимулировать лимфангиогенез и рост эндотелия сосудов при взаимодействии с VEGFR2. Аналогичные данные литературы известны и в отношении фактора роста VEGF-C. К факторам, блокирующим стимуляцию ангиогенеза опухолевой клеткой, следует отнести экспрессию растворимой формы рецептора VEGFR1s на плазматической клетке, который связывает некоторое количество фактора VEGF-A, конкурируя с расположенным на мембране клетки рецептором VEGFR1 за связывание с VEGF-A. Кроме того, VEGFR1, локализованный на клетках стромы, также будет связывать фактор VEGF-A, снижая его взаимодействие с VEGFR2. Следует отметить, что расположенные на мембранах плазматических и стромальных клеток рецепторы VEGFR1 и VEGFR3 могут связываться с экспрессируемыми этими клетками факторами роста семейства VEGF, обеспечивая тем самым аутокринный опухолевый рост.

Достаточно высокая активность экспрессии генов ФРЭС и их рецепторов свидетельствует о возможности поддержания опухолевого роста как по аутокринному, так и по паракринному механизму. Группа больных с низкой экспрессией генов ФРЭС характеризуется наличием опухолевых плазмоцитов, которые не оказывают ангиогенное воздействие на эндотелий сосудов микроокружения. Однако при наличии в этих опухолевых клетках экспрессии генов рецепторов поддержание их роста может обеспечиваться по паракринному механизму за счет влияния на опухолевую клетку ангиогенных факторов VEGF стромального микроокружения. В связи с этим данный тип ММ не будет характеризоваться интенсивным опухолевым ростом.

Полученные результаты позволяют нам выделить «васкулярный» (с наличием экспрессии генов) и «аваскулярный» (без экспрессии генов) типы ММ как самостоятельные патогенетически обусловленные варианты течения заболевания. Указание на подобные варианты течения болезни имелись и в работе А. Vacca, D. Ribatti [20]. При сравнительном анализе представленных результатов, прежде всего, следует обратить внимание на различие экспрессии генов ангиогенеза у этих групп больных.

Так, в «васкулярной» группе больных ММ мРНК генов факторов VEGF-A, VEGF-C и VEGF-D нам встречалась с частотой 100, 50 и 29,1% соответственно. В то же время у больных «аваскулярной» группы экспрессия аналогичных генов практически отсутствовала и составляла 0, 11,1% и 0 соответственно. В «васкулярной» группе больных частота выявления генов рецепторов VEGFR1, VEGFR1s, VEGFR2, VEGFR3 составила 83,3, 95,8, 12,5 и 29,1% соответственно. Следует также отметить меньшую частоту выявления экспрессии генов рецепторов ФРЭС у больных в «аваскулярной» группе по всем изучаемым рецепторам — VEGFR1, VEGFR1s, VEGFR2, VEGFR3, что составило 55,5, 66,6, 0 и 22,2% соответственно. Исходя из логической модели ангиогенеза, которая может быть сформулирована при анализе полученных данных, можно понять значение исследуемых генов в патогенезе опухолевого роста при ММ. У больных с «васкулярным» типом болезни опухолевые клетки имеют активно функционирующие гены ФРЭС и их рецепторного аппарата. При этом возникают предпосылки для активации пролиферативной активности эндотелия сосудов микроокружения. Кроме того, активный рецепторный аппарат этих клеток воспринимает сигналы VEGF клеток стромы и самих опухолевых клеток, вызывая активацию их роста по аутокринному и паракринному механизмам. У больных с «аваскулярным» типом болезни опухолевые клетки не будут активировать эндотелий стромы микроокружения, а рецепторный аппарат клеток будет взаимодействовать только с фактором роста VEGF, секретируемыми клетками стромы. В этом случае активность данных сигнальных систем будет ниже и в силу своей невысокой активности будет слабее активироваться опухолевый рост по аутокринному и паракринному механизмам.

Клиническая и цитологическая характеристика больных ММ с различной экспрессией генов ФРЭС и их рецепторов. При цитологической оценке аспиратов КМ в 2 группах больных проведен сравнительный анализ результатов подсчета кластеров миеломных клеток.

В группе из 24 больных с «васкулярным» типом количество кластеров миеломных клеток в аспиратах КМ было достоверно больше (3,76±1,16), чем в группе из 9 больных с «аваскулярным» типом (0,48±0,08; p<0,01). Среднее количество эндотелия сосудов в аспиратах КМ было достоверно больше у больных с «васкулярным» типом ММ, чем у больных «аваскулярным» типом (0,0075±0,001; p<0,001).

При визуальной оценке аспиратов КМ у больных с «васкулярным» типом определялись большие кластеры плазматических клеток как с эндотелием сосудов, так и без него (рис. 1, а),

В связи с высоким количеством кластеров опухолевых клеток в аспиратах КМ больных с коэкспрессией генов VEGF и их рецепторов представляло интерес проанализировать интенсивность остеолиза у этих больных. При оценке остеолитического процесса в костях скелета интенсивность остеолиза у больных с «васкулярным» типом была значительно выше, чем у больных с «аваскулярным» типом течения ММ: в среднем 1,76±0,12 и 0,8±0,31 балла (р<0,06).

При сравнении выживаемости в 2 группах выявлены статистически значимые различия (рис. 2).

Полученные данные отражают высокую значимость для диагностики, расширения знаний о патогенезе ММ и свидетельствуют, что мононуклеарная фракция КМ с преимущественным содержанием опухолевых плазматических клеток у больных ММ характеризуется различной степенью экспрессии генов ФРЭС и их рецепторов. Установлена высокая экспрессия растворимой формы молекулы гена VEGFR1s. Интегральная оценка полученной экспрессии генов ФРЭС и их рецепторов позволила разделить больных на 2 группы с высокой и низкой активностью генов. У больных с наличием экспрессии генов ФРЭС и их рецепторов количество кластеров и эндотелия сосудов в аспиратах КМ больных ММ достоверно выше, чем у больных с низкой экспрессией их или в их отсутствие. Данные исследования позволяют расширить возможности цитологической диагностики ММ за счет включения в оценку аспиратов КМ подсчета количества кластеров плазматических клеток и эндотелия сосудов. Повышенное количество кластеров, наличие эндотелия сосудов в аспиратах может быть предиктором тяжелого течения болезни. Остеодеструктивный процесс в костях скелета больных ММ у больных с экспрессией генов ФРЭС и их рецепторов достоверно выше, чем у больных с низкой их экспрессией. «Аваскулярный» тип ММ (с низкой активностью экспрессии исследованных генов) имел большую медиану общей выживаемости, чем «васкулярный» тип (с наличием экспрессии).

Таким образом, исследование позволило дать оценку процессам ангиогенеза при ММ и установить взаимосвязь с клиническими проявлениями и цитологическими характеристиками. Оценку экспрессии генов ФРЭС и их рецепторов при ММ следует проводить для более полной диагностики заболевания. Введение новой оценочной категории в описательную часть миелограммы при ММ (подсчет кластеров опухолевых плазматических клеток и эндотелия сосудов) позволяет определить прогноз заболевания и она может быть рекомендована к применению в широкой клинической практике.