Изучение устойчивости 2-метокси-4-(2-пропенил) гидроксибензола в биологическом материале

2-Метокси-4-(2-пропенил)гидроксибензол [син.: 2-метокси-4-аллилфенол, 2-метокси-4-проп-2-енилфенол, 2-метокси-1-гидрокси-4-аллилбензол, 2-гидрокси-5-аллиланизол, эвгенол; далее 2-МО-4-(2-П)ГОБ] — соединение со свойствами антисептика, легкого анестетика и антиоксиданта; получают путем синтеза, также из природных источников (эфирные масла растений Eugenia caryophyllata, Ocimum sanctum (tulsi), Ocimum basilicum, Cinnamomum verum, Myristica fragrans, Coluria geoides, Piménta racemósa и др.) [1—5].

Описано противогрибковое действие 2-МО-4-(2-П)ГОБ и родственных соединений [6]. Показано, что в эксперименте на крысах применение местных и пероральных форм эвгенола снижает фиброз и предотвращает развитие мирингосклероза в краткосрочной перспективе [7]. Имеются данные о противотуберкулезном, противовоспалительном и антимутагенном действии данного соединения [8], а также сведения об антидепрессивном и противоглистном эффектах вещества [9].

2-МО-4-(2-П)ГОБ применяется в стоматологии, парфюмерии, пищевой промышленности, органическом синтезе, в том числе веществ с выраженной фармакологической активностью [10—14].

2-МО-4-(2-П)ГОБ — это прозрачная, не обладающая окраской или желтоватая жидкая субстанция со своеобразным приятным запахом; кипит при температуре 253,2 °C; pKa=10,19 при температуре 25 °C; logP=2,27. Растворимость вещества в воде составляет 2460 мг/л при температуре 25 °C [1]. 2-МО-4-(2-П)ГОБ смешивается с этанолом, хлороформом, эфиром, маслами; 1 мл растворяется в 2 мл 70% этанола; растворим в ледяной уксусной кислоте и водных растворах гидроксидов щелочных металлов [15]. Плотность вещества 1,0652 г/см³ при температуре 20 °C [16].

Как и ряд других 2-метоксигидроксибензолов, 2-МО-4-(2-П)ГОБ проявляет в отношении теплокровных токсические свойства. LD₅₀ при пероральном введении крысам 1930 мг/кг, мышам — 3000 мг/кг, морским свинкам — 2130 мг/кг [17], при интратрахеальном введении составляет 11 мг/кг для самцов крыс F-344 и 17 мг/кг для самцов сирийских золотых хомяков [18].

В отечественной и зарубежной литературе [19—23] приводятся данные об острых, в том числе летальных, отравлениях 2-МО-4-(2-П)ГОБ (обычно попадает в организм в составе сложных природных смесей соединений), а также близкими 2-метоксигидроксибензолами. Это определяет значительный интерес к 2-МО-4-(2-П)ГОБ как к объекту судебно-химического исследования.

Изучен ряд вопросов изолирования из биоматериала, очистки и определения данного аналита. Некоторые аспекты химико-токсикологического анализа 2-МО-4-(2-П)ГОБ остаются недостаточно разработанными. К ним, в частности, относятся вопросы сохраняемости аналита в биоматрицах.

Цель исследования — изучение устойчивости 2-МО-4-(2-П)ГОБ в биологическом материале.

Исследуемый объект — 2-МО-4-(2-П)ГОБ) фирмы «Merk» (ФРГ), содержащий ≥98% основного вещества. Модель биоматрицы — ткань печени в состоянии дисперсности 2—4 мм, достигнутой измельчением хирургическими ножницами при температуре 0—2 °C. На ее основе готовили модельные смеси с аналитом (дисперсность 5—40 мкм), концентрация которого в биоматрице составляла 0,1% [24]. Приготовленные таким образом модельные смеси сохраняли без доступа света, при относительной влажности 50—70% и давлении 100±2 кПа при 5 температурах: –22 °C (температура января Северной России), 4 °C (температура октября Центральной России), 12 °C (температура апреля Центральной России), 20 °C (комнатная температура, температура июля Центральной России) и 30 °C (температура июля Южной России). В этих же условиях выдерживали контрольные образцы биоматериала (дисперсность 2—4 мм).

В процессе сохранения модельные смеси и образцы контрольной биоматрицы подвергали через определенные временные интервалы исследованию на присутствие аналита с параллельной оценкой его количественного содержания.

Для идентификации и количественного определения 2-МО-4-(2-П)ГОБ в сохраняемом биоматериале применили следующую методику.

Настаивали 5 г биологического объекта со смесью этилацетат-ацетон (7:3 по объему; 10 г×2); продолжительность каждого настаивания — 30 мин. Оба извлечения сливали в выпарительную чашку и испаряли в токе воздуха (температура 18—22 °C) до удаления растворителей. Остаток обрабатывали 10 мл трихлорметана, раствор экстрагировали 0,37% HCl (20 мл×2). Полученный кисловодный экстракт встряхивали с 40 мл диэтилового эфира в течение 3 мин, органический слой удаляли, в водный слой вводили высаливатель (NaCl) в количестве 3,6 г, pH образующегося раствора доводили до 8,0—9,0 10% раствором NaOH, после чего экстрагировали этилацетатом (40 мл ×2), а экстракт испаряли при температуре 18—22 °C в токе воздуха. Остаток растворяли в 2—3 мл смеси гексан-диоксан (8,5:1,5), раствор вносили в полупрепаративную (190×10 мм) колонку силикагеля L 40×100 мкм и элюировали смесью гексан-диоксан (8,5:1,5). Сбор элюата проводили фракциями по 2 мл. Те фракции, в которых мог присутствовать 2-МО-4-(2-П)ГОБ [с 10-й по 12-ю (19—24 мл) включительно], сливали в выпарительную чашку, а элюент испаряли.

Остаток обрабатывали 5—8 мл трихлорметана, раствор количественно переносили в мерную колбу (объем 10 мл) и доводили уровень содержимого колбы трихлорметаном до метки (раствор для исследования). В выпарительные чашки 1 и 2 помещали по 0,5—2,5 мл раствора для исследования, растворитель испаряли.

Остаток в чашке 1 растворяли в 4 мл трихлорметана, 4 мкл этого раствора исследовали методом ГХ-МС. Пробу вводили с делением потока 1:2. В работе использовали прибор Agilent Technologies модели 6850 Network с масс-селективным детектором модели 5973 Network. Хроматографировали в колонке DB-5 ms EVIDEX (25 м×0,2 мм) с неподвижной фазой 5%-фенил-95%-метилполисилоксан толщиной 0,33 мкм. Условия определения: температура инжектора 250 °C, интерфейса детектора 300 °C, квадруполя 150 °C. Начальную температуру колонки (70 °C) выдерживали 3 мин, затем повышали до 290 °C со скоростью 20 °C/мин, газ-носитель — гелий, его скорость 0,6 мл/мин, способ фрагментации молекул — электронный удар (70 эВ), диапазон сканирования 40–400 m/z (режим регистрации — по полному ионному току). Аналит идентифицировали по времени удерживания (9,63 мин) и группе сигналов заряженных частиц (m/z) в масс-спектре [41, 55, 65, 77, 91, 103, 121, 131, 137, 164 (базовый и одновременно молекулярный ион)].

Остаток в чашке 2 растворяли в 0,2—0,4 мл этилацетата, количественно переносили на линию старта пластины «Сорбфил» ПТСХ-АФ-А-УФ и осуществляли определение, применяя подвижную фазу гексан-диоксан-пропанол-2 (40:5:1). Хроматограммы проявляли в УФ-свете, аналит илентифицировали по величине Rf (0,69±0,03).

Аналит вымывали из сорбента 5 (10) мл 95% этанола в течение ¹/₄ часа. Полученный раствор спектрофотометрировали (прибор СФ-2000; l=10 мм) в области 200—360 нм, идентифицируя аналит по форме спектральной линии и точкам максимумов (λ_max=210, 228, 281 нм). По оптической плотности, регистрируемой в области 281 нм, рассчитывали количество 2-МО-4-(2-П)ГОБ в биоматериале, используя уравнение градуировочного графика: А=0,020725·С+0,001312, где А — оптическая плотность, С — концентрация аналита (мкг/мл) в фотометрируемом образце.

Результаты определения содержания аналита в биоматрице на разных этапах сохранения биоматериала при 5 температурах представлены на рис. 1 и 2.

Рис. 1. Результаты определения содержания (R, %) 2-МО-4-(2-П)ГОБ в биологическом материале в условиях сохранения при температуре –22 °С (1) и 4 °С (2).

Рис. 2. Результаты определения содержания (R, %) 2-МО-4-(2-П)ГОБ в биологическом материале в условиях сохранения при температуре 12 °С(1), 20 °С(2) и 30 °С(3).

Как видно на рисунках, продолжительность сохранения 2-МО-4-(2-П)ГОБ в ткани печени при температуре –22 °C, 4 °C, 12 °C, 20 °C и 30 °C составляет соответственно 385, 357, 301, 245 и 217 сут.

Предприняли попытку описания и возможного прогнозирования процесса разложения 2-МО-4-(2-П)ГОБ в биологическом материале с помощью определенной математической модели.

Установили, что, начиная приблизительно с момента, соответствующего времени полуразложения первоначально определенного (в 1-е сутки сохранения) количества аналита в биоматрице, кривая зависимости содержания 2-МО-4-(2-П)ГОБ в искусственных смесях от времени сохранения смесей при определенной температуре приближается к форме гиперболы и, очевидно, может быть описана ее уравнением y= k/x, которое применительно к данному случаю имеет вид: R, % = k/t_c, где R, % — содержание аналита в сохраняемом биоматериале, t_c — продолжительность сохранения в сутках, k — коэффициент в уравнении гиперболы.

Исходя из результатов изучения зависимости содержания 2-МО-4-(2-П)ГОБ в биоматрице (R,%) от продолжительности (t_c) сохранения биоматериала при определенной температуре (пять параллельных опытов), рассчитывали значение коэффициента k для каждой точки графика зависимости. Из всей совокупности n единичных значений k_i находили среднее значение k_ср и вычисляли отклонение (в виде относительной погрешности ε,%) каждого единичного значения от среднего (k_ср) по формуле: ε,% = (k_i — k_ср)/ k_ср ∙100%.

Результаты представлены в табл. 1 и 2, из которых видно, что рассчитанные значения относительной погрешности не превышают ±20%.

Таблица 1. Характеристика графиков гиперболической зависимости содержания 2-МО-4-(2-П)ГОБ в биоматрице от продолжительности сохранения при температуре –22 °С и 4 °С

Примечание. Здесь и в табл. 2: t_с — продолжительность сохранения, сутки; R — содержание аналита в биоматрице; k_i — коэффициент в уравнении гиперболы для отдельной точки графика; k_ср — среднее значение коэффициента для выборки из n значений k_i; ε — относительная погрешность (отклонение k_i от k_ср).

Таблица 2. Характеристика графиков гиперболической зависимости содержания 2-МО-4-(2-П)ГОБ в биоматрице от продолжительности сохранения при температуре 12 °С, 20 °С и 30 °С

Значения k_ср в уравнениях гиперболы, описывающих динамику разложения 2-МО-4-(2-П)ГОБ в ткани печени, при температурах сохранения –22 °C, 4 °C, 12 °C, 20 °C и 30 °C составляют соответственно 6223, 3036, 2387, 1903 и 932. По результатам расчета значений k_ср строили график зависимости k_ср от температуры сохранения биоматериала t^о.

Установили, что в рассматриваемом температурном интервале (–22 °C — +30 °C) подобная зависимость для 2-МО-4-(2-П)ГОБ в целом близка к линейной форме и может быть описана уравнением прямой линии y = a∙x+ b или применительно к данному случаю k_ср=a∙(50—t°)+b, где k_ср — коэффициент в уравнении гиперболы, t° — температура сохранения, 50 — постоянное число, при вычитании из которого значений температуры сохранения удается получить числовые значения, с которыми в прямо пропорциональной зависимости находятся значения коэффициента k_ср в уравнении гиперболы.

С учетом рассчитанных методом наименьших квадратов параметров a∙и b данное уравнение имеет вид: k_ср=101,19∙(50—t°)—1272,78. Основываясь на этом уравнении, можно прогнозировать особенности процесса разложения 2-МО-4-(2-П)ГОБ в биоматериале (ткань печени) при той или иной температуре, входящей в изученный температурный интервал. Для этого сначала находят значение k_ср, соответствующее интересующей температуре, затем на основе найденного коэффициента k_ср рассчитывают гиперболическую кривую теоретической зависимости содержания аналита (R, %) от продолжительности сохранения (t_c).

Используя разработанный подход, спрогнозировали характер разложения аналита в ткани печени при температуре –10 °C (температура января Центральной России), входящей в изученный температурный интервал. Подставив в предварительно выведенное уравнение k_ср=101,19∙(50—t°)—1272,78 значение t°= –10 °C, находим k_ср (коэффициент в уравнении гиперболы), который оказался равным 4799. Исходя из величины k_ср, рассчитываем гиперболу — математическую модель зависимости содержания 2-МО-4-(2-П)ГОБ в биоматрице (R, %) от продолжительности сохранения биоматериала (t_c).

Учитывая, что первоначально определяемая степень извлечения составляла около 90%, величина степени полуразложения 2-МО-4-(2-П)ГОБ находилась примерно в области 45%.

Провели сравнение теоретической (прогнозируемой) зависимости содержания аналита в биоматериале (ткань печени) при температуре –10 °C от продолжительности сохранения (гиперболическая модель) с результатами изучения сохраняемости 2-МО-4-(2-П)ГОБ в эксперименте при этой же температуре (табл. 3).

Таблица 3. Сравнение прогнозируемого и найденного экспериментально содержания 2-МО-4-(2-П)ГОБ в биоматрице для режима сохранения при температуре –10 °С

Как свидетельствуют полученные данные, во временном диапазоне, начиная с времени полуразложения первоначально определенного количества аналита (105 сут) и до 385 сут сохранения, различие между содержанием, рассчитанным теоретически (гиперболическая кривая), и соответствующим значением, полученным в эксперименте, составляет не более ±20%.

1. Изучена устойчивость 2-МО-4-(2-П)ГОБ в биологическом материале (ткань печени) в пяти температурных режимах: –22 °C, 4 °C, 12 °C, 20 °C и 30 °C. Продолжительность сохранения аналита при этом составила соответственно 385, 357, 301, 245 и 217 сут.

2. Установлено, что динамика разложения 2-МО-4-(2-П)ГОБ в ткани печени при указанных температурах может быть математически описана уравнением гиперболы.

Рассчитанные по данным эксперимента коэффициенты в уравнении гиперболы (k_ср) для температуры –22 °C, 4 °C, 12 °C, 20 °C и 30 °C оказались равными соответственно 6223, 3036, 2387, 1903 и 932.

3. На основе вычисленных значений k_ср рассчитано уравнение выявленной линейной зависимости k_ср от температуры сохранения t^о, имеющее вид: k_ср=101,19∙(50–t°)–1272,78.

Показана возможность использования данного уравнения для прогнозирования процесса разложения 2-МО-4-(2-П)ГОБ в биоматериале при заданной температуре в интервале от –22 °C до 30 °C.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.