Проблема диагностики прижизненности и давности образования повреждений существует столько, сколько существует судебно-медицинская экспертиза. Установление экспертным путем прижизненности и давности, или, как принято называть в западной литературе, тайминг повреждений, имеет четкую правовую проекцию, поскольку обеспечивает правоохранительные и правоприменительные органы информацией о времени образования повреждений и, что не менее важно, закладывает основу их последующей правовой квалификации.

Доказать прижизненность и установить давность образования повреждений — это, по сути, один из важнейших этапов производства судебно-медицинской экспертизы трупа. От качества выполнения этого этапа зависит как правильность выводов эксперта, так и последующая юридическая перспектива дела.

Таким образом, решение вопросов, касающихся данной темы, является одной из важных и приоритетных задач [1]. Классические методы определения этапов воспалительно-репаративного процесса, широко применяемые сегодня, недостаточно удовлетворяют современным требованиям вследствие невозможности с их помощью установить изменения, происходящие на ранних сроках после получения травмы, так как не могут выявить процессы, происходящие на молекулярном уровне. Для этих целей целесообразно применять иммуногистохимические (ИГХ) методы.

При разработке ИГХ-методов диагностики прижизненности и давности повреждений, поиске новых маркеров, пригодных для этой цели, исследователи руководствуются знаниями о происходящих в поврежденной ткани химических процессах межклеточного взаимодействия, обусловливающих развитие воспалительно-репаративной реакции и в конечном счете направленных на заживление повреждения.

Выбор того или иного антигена для изучения в качестве потенциального маркера определяется его источником, а также временем после причинения травмы, в течение которого данный антиген начинает обнаруживаться в поврежденной ткани. Присутствие либо отсутствие того или иного маркера должно являться одним из результатов реакции организма на воздействие патологического агента. Такого маркера не должно быть при нормальном состоянии и в посмертных повреждениях. Интервал времени его обнаружения по возможности должен быть узким и неизменным. Наибольший интерес представляют маркеры, которые можно обнаружить уже с первых минут существования повреждения и которые, таким образом, могут указывать на прижизненность травмы.

В судебно-медицинском аспекте одними из первых этим вопросом занимались W. Grellner и соавт. [2]. Они изучали пептидные факторы роста TGFα и TGFβ1 в 125 образцах кожных ран и контрольных. Результаты показали, что определение гиперэкспрессии TGFα в эпидермисе, особенно в его шиповатом слое, возможно в повреждениях давностью более 10—20 мин. Гиперэкспрессия TGFβ1 в некоторых структурах кожи, особенно в области кровоизлияний, достигала максимума в течение 30 мин; примерно в ⅓ повреждений начиналась с первых минут после их причинения.

T. Kondo положительно высказывается о возможности использования TGFβ1 и TGFα для оценки прижизненности повреждений. В качестве перспективного метода автор рассматривает определение экспрессии нескольких маркеров одновременно, т.е. использование панели антител [3, 4].

P. Betz и соавт. [5] провели ИГХ-исследование фибронектина. Исследовали 53 прижизненные раны, разделенные на группы по давности причинения. Контролем служили шесть экспериментальных посмертных ран. В 10 из 17 исследованных ран давностью до 30 мин обнаружили отчетливое положительное окрашивание стромы на фибронектин; отсутствие реакции в оставшихся 7 образцах авторы объяснили чрезвычайно коротким периодом переживания (секунды).

Авторы пришли к выводу, что фибронектин является полезным маркером для определения прижизненности ран давностью более нескольких минут и появляется до начала лейкоцитарной реакции. Спустя 3 года P. Betz объединил результаты нескольких исследований, создав в обзоре первый прототип схемы для оценки давности повреждений по нескольким маркерам, рассчитанной на определение давности раны до 3 нед [6].

W. Grellner и соавт. [7] поставили под сомнение ранее полученные данные о перспективности исследования фибронектина как маркера прижизненности и давности. В своих экспериментах с кожей свиней авторы получили положительную реакцию на фибронектин в половине (18 из 36) образцов посмертно причиненных повреждений. В опубликованном в 2007 г. обзоре W. Grellner и B. Madea к перспективным маркерам раннего (до 1 ч) периода заживления повреждений отнесли не только TGFβ1, TGFα и другие маркеры, с которыми они добились положительного результата, но и фибронектин, что противоречит собственным предыдущим исследованиям [8].

J. Balazic и соавт. исследовали экспрессию фибронектина в мягких тканях с огнестрельными повреждениями с коротким периодом переживаемости, оценивая интенсивность и распространенность реакции. По результатам был сделан вывод, что фибронектин является надежным маркером прижизненности раны и инструментом определения ее давности [9].

Многие исследователи в качестве маркеров ранней реакции на повреждение пытались применять цитокины, в частности, интерлейкины. Так, W. Grellner и соавт. в своих исследованиях изучали интерлейкин-1β (IL-1β), IL-6 и α-фактор некроза опухоли (TNFα) в 105 операционных и секционных образцах колото-резаных ран человека давностью от нескольких минут до 6 нед.

Повышенную экспрессию IL-1β и IL-6 в клетках эпидермиса, сосудов и потовых желез они отмечали соответственно уже через 15 и 20 мин, а максимум — через 30—60 и 60—90 мин. Повышенную экспрессию TNFα наблюдали через 15 мин с максимумом к 60—90-й минуте. Аутолиз при давности смерти до 8 сут не искажал результаты исследований. Проанализировав результаты, авторы порекомендовали использовать в качестве контроля образцы от того же субъекта для индивидуального определения уровня базовой экспрессии маркеров [10, 11].

J. Dressler и соавт. по результатам исследования молекулы клеточной адгезии ICAM-1 (CD54) пришли к выводу, что этот антиген можно рассматривать в качестве маркера прижизненности, поскольку его выраженная экспрессия наблюдается в поврежденных тканях в период от 1,5 ч до 3 сут от момента причинения повреждения. Они также отметили, что только CD54 для решения вопроса о прижизненности и давности недостаточно [12]. Аналогичные результаты авторы получили для молекулы эндотелиальной адгезии VCAM-1 (CD106), наблюдая отчетливую положительную реакцию в период от 3 ч до 3 сут [13, 14].

На большом материале (465 образцов ран) J. Dressler и соавт. провели ИГХ-исследование с ICAM-1, VCAM-1, P- и Е-селектинами. Положительный результат наблюдали для ICAM-1 через 1,5 ч, P-селектина через 3 мин, E-селектина через 1 ч, VCAM-1 через 3 ч после причинения повреждения. В качестве контроля использовали неповрежденную кожу и посмертно причиненные экспериментальные повреждения, однако о результатах исследования последних авторы не сообщили [15].

Исследование J. Ortiz-Rey и соавт. оказалось критическим по отношению к сторонникам изучения P-селектина в качестве ИГХ-маркера прижизненности повреждений. По результатам изучения 45 образцов ран (24 прижизненных, 14 посмертных экспериментальных, 7 с аутолитическими и гнилостными изменениями) установили отсутствие достоверных различий уровня экспрессии P-селектина в прижизненных и посмертных повреждениях. По мнению авторов, выявление P-селектина в посмертных повреждениях не позволяет считать его надежным маркером прижизненности [16].

N. Van der Laan и соавт. первыми обозначили проблему зависимости ИГХ-проявлений динамики процессов заживления от вида и локализации повреждений. Исследовав 21 взятый образец при биопсии, включая хирургические и инфицированные раны, кожу в проекции перелома бедра, они установили различия в сроках экспрессии практически всех указанных к тому времени в исследованиях потенциальных маркеров, включая Е- и Р-селектин, интерлейкины, ICAM-1, VCAM-1 [17].

А.М. Хромова подвергла ИГХ-анализу 18 секционных образцов ран давностью от 2—3 мин и установила во всех случаях высокую экспрессию Р-селектина в эндотелии сосудов. Сделав вывод о пригодности Р-селектина для оценки прижизненности повреждений, автор тем не менее не сообщила об исследовании контрольных образцов интактных и посмертно поврежденных тканей, что не позволяет судить о специфичности выбранного ею маркера [18].

В 2003 г. А.М. Хромова продемонстрировала оригинальный подход, сообщив об исследовании экспрессии E- и Р-селектина в посмертно выраженно измененных образцах трупной ткани (фрагмент мозгового вещества и зуб). Основываясь на отсутствии экспрессии Р-селектина, автор сделала экспертный вывод об отсутствии прижизненных повреждений [19], однако не приняла в расчет аутолитические изменения тканей.

В 2010 г. опубликованы разработки R. Cecchi, которая изучала экспрессию Р-селектина, полагая, что он является достаточно надежным маркером прижизненности повреждений. По ее данным, повышенная экспрессия Р-селектина обнаруживается в эндотелиальных клетках сосудов кожи уже через 1 мин после причинения повреждения, достигая максимума через 10—15 мин. В других исследованиях повышенная экспрессия выявлялась в период от 3 мин до 7 ч. Базовая экспрессия Р-селектина достаточно вариабельна, поэтому автор рекомендует проводить ее оценку обязательно в сравнении с негативным контролем образца кожи того же субъекта.

Для выбора надежных маркеров прижизненности повреждений R. Cecchi рекомендует полагаться на те, которые в норме вообще не присутствуют в неповрежденных тканях; к таким маркерам отнесены IL-1β, TNFα и IL-6 (все в кератиноцитах), VCAM, а также селектины Е и P. Кроме того, могут быть использованы вещества, которые никогда не присутствуют в посмертных повреждениях: лейкотриен-β4, катепсины А и D, D-димер фибрина.

Автор положительно отзывается о перспективах исследования TGFβ1, указывая, что он в норме экспрессируется только в соединительной ткани. О возможности применения ряда маркеров, в том числе фибрина и фибронектина, простагландинов, гистамина, протеаз, R. Cecchi высказывается критически, считая получаемые с их помощью результаты недостоверными [20].

W. Grellner и B. Madea [8] к перспективным маркерам раннего (до 1 ч) периода заживления повреждений относят не только TGFβ1, TGFα, IL-1β, IL-6, TNFα, ICAM-1, VCAM-1, рекомендованные различными авторами согласно полученным положительным результатам, но и фибронектин, E- и Р-селектины, по поводу которых ранее были получены противоречивые данные.

Обзор данных литературы о ИГХ-маркерах, пригодных для определения давности повреждений в мягких тканях и головном мозге, подготовил M. Oehmichen [21]. Автор сделал вывод, что данный вопрос требует дальнейшего изучения.

G. Gauchotte и соавт. [22] указали, что к наиболее перспективным для изучения маркерам можно отнести TNFα, IL-6, IL-1β, TGFα и TGFβ1. Особое внимание в обзоре этих авторов обращено на необходимость многократной проверки результатов исследований на посмертных экспериментальных повреждениях, поскольку многие ранее исследованные маркеры оказались ненадежными именно по причине положительной реакции в посмертных повреждениях (например, фибронектин, P-селектин).

Большой вклад в изучение иммуногистохимии тканевых реакций внесли F. Van de Goot и J. Fronczek [23]. Проведя огромный объем исследований (более 800 образцов кожи), они разработали вероятностную систему оценки прижизненности и давности повреждений кожи, основываясь на уровне экспрессии фибронектина, Р-селектина и фактора VIII. Следует отметить, что ни один из указанных маркеров не показал абсолютно определяемых результатов, которые можно было бы интерпретировать без применения вероятностных методов оценки.

В исследовании «Действительно ли Р-селектин и фибронектин полезны в оценке прижизненности?» C. Capatina и соавт. [24] свидетельствуют о пригодности указанных маркеров для диагностики прижизненности, но в то же время о непригодности для диагностики давности, поскольку корреляция между их экспрессией и давностью повреждений не была обнаружена. Следует отметить, что исследование проведено всего на 17 секционных образцах прижизненных повреждений, ни о каком контроле авторы не сообщили.

Большой интерес представляет работа A. Bonelli и соавт. [25], посвященная судебно-медицинскому аспекту изучения реакции тучных клеток на повреждение тканей. Авторы провели морфометрическое исследование плотности расположения тучных клеток (на 1 мм² площади среза) в краях повреждений кожи, предварительно осуществив их ИГХ-маркировку окраской на триптазу и химазу. Установили достоверное различие плотности расположения тучных клеток в образцах прижизненных ран давностью от нескольких секунд до 1 ч по сравнению с неповрежденной кожей и посмертно поврежденной. В то же время авторы не обнаружили сколько-нибудь значимых изменений в уровне дегрануляции тучных клеток.

В судебно-медицинском аспекте динамику дегрануляции тучных клеток в перифокальной зоне повреждений изучал M. Oehmichen [26, 27] и получил положительные результаты.

Этому же вопросу, а также определению экспрессии в поврежденных мягких тканях фактора VIII, CD-15 и триптазы посвящены разработки G. Gauchotte и соавт. [28]. Только методика определения дегрануляции, по мнению авторов, обладала достаточными чувствительностью (75%) и специфичностью (100%) для отнесения к надежным методам диагностики прижизненности.

Таким образом, в вопросе о возможности исследования реакций тучных клеток в целях диагностики прижизненности повреждений имеются существенные противоречия. Одни авторы считают надежным признаком изменение плотности расположения тучных клеток и ненадежным — дегрануляцию, другие придерживаются противоположного мнения.

Y. Ishida и соавт. исследовали экспрессию аквапоринов AQP1 и AQP3 в образцах кожи шеи, полученных от 56 трупов с компрессией шеи (35 — повешение, 21 — удавление). Неповрежденная кожа служила контролем. Резко выраженную и достоверную гиперэкспрессию AQP-3 наблюдали в кератиноцитах в области компрессии кожи. По мнению авторов, обнаружение высокой экспрессии AQP3 можно считать ценным маркером для диагностики прижизненности компрессии шеи. Об исследовании образцов с посмертной экспериментальной компрессией сведений в работе нет [29].

Аналогичные результаты для AQP-3 ранее получили H. Kubo и соавт. [30] при исследовании прижизненных и посмертных ожогов. Достоверная разница была получена авторами только в результатах количественного определения экспрессии генов, ответственных за синтез AQP3; иммуногистохимическое окрашивание кератиноцитов перифокальной зоны на AQP3 не выявило достоверных различий в прижизненных и посмертных ожогах.

В главе руководства по аутопсийной практике, посвященной вопросам диагностики прижизненности и давности повреждений, F. Van de Goot и J. Fronczek [31] относят к перспективным маркерам ранней давности повреждений (в порядке возрастания времени начала обнаружения) фактор VIII, фибронектин, Р-селектин, CD31, глюкофорин, катепсин D, TNFα, Е-селектин, TGFβ. Авторы считают, что наличие положительного и отрицательного контроля при исследованиях обязательно. Для каждого из названных маркеров приведена подробная шкала оценки экспрессии в соответствующих структурах от 0 до 3. По мнению авторов, результаты ИГХ-реакций на различные маркеры должны быть сопоставимы между собой в соответствии с известным временем появления их в поврежденных тканях; исследование только одного антигена не представляет доказательной ценности.

К аналогичному выводу о необходимости панельного исследования нескольких маркеров и последующего сопоставления данных пришли A. Fieguth и соавт. [32], а позже M. Takamiya и соавт. [33].

W. Grellner и B. Madea [8] определили перспективные направления изучения ИГХ-маркеров прижизненности и давности образования повреждений, а также выделили факторы, которые влияют на скорость развития воспалительных процессов в поврежденных тканях. К таким факторам они относят вид, протяженность и выраженность повреждения, тип поврежденной ткани, температуру тела и состояние местного кровообращения, возраст, пол, состояние питания, наличие заболеваний, эндокринных и метаболических нарушений, воздействие экзогенных факторов. К аналогичным выводам пришла R. Cecchi [20].

Как видно из приведенного анализа данных литературы, публикации зарубежных авторов о ИГХ-исследовании прижизненности и давности повреждений не слишком многочисленны, порой противоречивы и в большинстве случаев являются аналитическими обзорами литературы. Разработки российских судебных медиков еще более минималистичны.

Одна из ранних отечественных публикаций о возможностях ИГХ-исследования маркеров прижизненности и давности ран — работа Г.М. Харина и соавт. [34]. В ней представлены краткий обзор результатов исследований зарубежных авторов и данные собственных экспериментальных наблюдений за течением ожогов и ран у крыс. Указано, что целесообразно разрабатывать одновременное применение набора маркеров различных клеточных элементов и тканевых структур (панели моно- и поликлональных антител); получаемую при этом информацию следует объективизировать путем использования различных приемов морфометрического анализа, позволяющих на ИГХ-препаратах определять точную локализацию, а также количественное соотношение клеточных элементов и тканевых структур в зоне повреждения.

В 2014 г. основные данные из опубликованных наблюдений были кратко обобщены в обзоре Е.И. Сурковой, посвященном основным исследованным маркерам давности колото-резаной травмы [35].

В том же году вышла статья Д.В. Богомолова и соавт. [36] о перспективах использования методов ИГХ для установления прижизненности и давности механических повреждений. По заключению авторов, скорейшее внедрение методов ИГХ в науку и практику судебно-медицинской экспертизы позволит повысить аргументацию ответов на многие экспертные вопросы.

Д.В. Богомолов и соавт. в 2016—2017 гг. опубликовали статьи, посвященные ИГХ-диагностике прижизненности странгуляционной механической асфиксии [37, 38]. В них показаны перспективность использования фибриногена и нецелесообразность применения фибронектина в качестве маркера прижизненности странгуляции.

В статье, вышедшей в 2018 г., приведены результаты исследования странгуляционных борозд и ткани легких, проведенного с более широким спектром маркеров: общий цитокератин, фибриноген, иммуноглобулин l, фибронектин и CD-117. В дерме и подкожной основе валиков прижизненных странгуляционных борозд наблюдали достоверно высокую экспрессию фибриногена и иммуноглобулина λ по сравнению с таковой в посмертных бороздах и участках контрольной интактной кожи. У лиц, скончавшихся от механической асфиксии, в зонах мелкоочагового отека легких фибриноген не обнаруживался, а экспрессия фибронектина была слабой и локализовалась только в венулах подкожной основы, в то время как CD-117 имел значительную очаговую экспрессию в клетках межальвеолярных перегородок, что доказывает дифференцирующую роль маркера острой альвеолярной гипоксии [39].

Подводя итог анализа опубликованных в специальной литературе результатов исследований, можно отметить, что к настоящему времени проблема ИГХ-оценки давности повреждений находится на более близком к решению этапе, чем проблема диагностики прижизненности. Изучение динамики появления различных маркеров в ране привело некоторых исследователей к мысли о создании систем, позволяющих устанавливать давность повреждений на основании совокупности положительных и отрицательных реакций на те или иные вещества с известными сроками их появления в поврежденных тканях. Применение таких ИГХ-панелей должно в ближайшем будущем послужить инструментом уточнения результатов, получаемых методами классической гистологии на основании изучения клеточных реакций.

Вопрос диагностики прижизненности повреждений остается практически таким же острым, как и до использования ИГХ-методов, так как пока не найдены надежные маркеры ранних прижизненных реакций. Как и в классической гистологии, основные трудности связаны с явлением переживаемости тканей и их способности имитировать некоторые «прижизненные» реакции уже после смерти всего организма в целом, т.е. после остановки кровообращения.

Явление переживаемости, хорошо известное специалистам в области классической судебно-медицинской гистологии и вносящее коррективы в трактовку наблюдаемых ранних реакций (перифокальные кровоизлияния и сосудистые реакции), осложняет интерпретацию результатов ИГХ-исследований, всегда ставя перед специалистами вопрос: не может ли выбранный маркер экспрессироваться посмертно? Ни один из авторов изученных исследований пока не дал четко аргументированных практических рекомендаций по ИГХ-диагностике прижизненности травмы. Поиск новых маркеров раннего срока давности повреждений и оценка их надежности должны быть продолжены.

В таблице обобщены сведения из источников об основных исследованных ИГХ-маркерах со временем начала экспрессии в поврежденной коже не более 30 мин.

Наиболее перспективными для дальнейших собственных исследований нам представляются TGFβ1 и AQP3 как выявляемые наиболее рано и к настоящему времени не показавшие непригодных результатов в контрольных образцах. Заслуживает внимания P-селектин, несмотря на наличие ряда противоречивых отзывов о его ненадежности. Кроме того, интересным методом может оказаться морфометрия плотности тучных клеток с использованием их ИГХ-детекции.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.