Первая часть данной работы [1] была посвящена разработке методики прогностического скрининга волос человека для определения перспективности образца и целесообразности его генотипирования.

Цель исследования — оптимизация процедуры генотипирования ядерной ДНК (яДНК), содержащейся в волосах человека.

Согласно нашим данным, исследование волос с содержанием в луковице ядер в количестве более 100, как правило, не представляет трудностей, так как концентрация яДНК в этом случае достаточна для проведения генотипирования по стандартному протоколу. Сложности возникают при исследовании «проблемных» волос, в луковицах которых менее 100 ядер, что типично для волос телогеновой фазы роста. Большая часть этого массива соотносима с объектами, содержащими предельно малые количества яДНК, т. е. LCN-объектами. В таких случаях применимы методы LCN-анализа. В литературе малое содержание яДНК в объекте — 0,02 нг/мкл и менее обозначают как LCN (Low Copy Number) [2]. Кроме того, при выборе тактики генотипирования следует учитывать, что для волос в телогеновой фазе роста характерна деградация яДНК [3]. В работе [3—7] использовали следующие методические подходы, позволяющие повысить чувствительность определения: уменьшение объема элюата (элюирующий раствор) при выделении яДНК; изменение условий амплификации (время и температура циклирования, количество циклов); очистку амплификатов от низкомолекулярных компонентов, анализ параллельных проб, типирование мини-STR-локусов.

Исследовали волосы, отобранные на этапе скрининга по наличию эпителиальных тканей и количеству ядер, обнаруженных в корневом конце (см. таблицу).

Для выделения ДНК в соответствии с инструкциями производителей использовали следующие наборы: Tissue and Hair Extraction Kit и DNAIQ System («Promega Сorporation», США); QIAamp DNA Investigator Kit и QIAamp DNA Micro Kit (QIAGEN, Германия); PrepFiler Forensic DNA Extraction Kits и Arcturus PicoPure DNA Extraction Kit («Applied Вiosystems», США); М-сорб для выделения ДНК из клинических образцов (ЗАО «Синтол», Москва); innuPREP Forensic Kit («Analytic Jena AG Life Science», Германия). Ионообменную смолу Chelex 100 Resin («Bio-Rad Laboratories», США) применяли в соответствии с методикой, представленной в Users guide AmpliType, («PerkinElmer», США).

Выделенную ДНК оценивали с помощью набора реагентов для определения количества фрагментов ДНК человека XY-Детект (ЗАО «Синтол», Москва) [8] и анализатора нуклеиновых кислот АНК-32 (ИАП РАН, Санкт-Петербург).

Генотипирование выполняли с использованием наборов AmpFlSTR Identifiler Plus PCR Amplification Kit и AmpFlSTR Minifiler PCR Amplification Kit («Applied Biosystems», США). Реакцию амплификации проводили на ДНК-амплификаторе GeneAmp PCR System 9700 Gold («Applied Biosystems», США), электрофорез — на генетическом анализаторе 3500xL Genetic Analyzer («Applied Biosystems/Hitachi», США) в среде полимера РОР-4. Обработку результатов и идентификацию аллелей проводили с помощью программы GeneMapper ID-Х («Applied Biosystems», США). Амплификацию выполняли с использованием протоколов, рекомендованных в инструкциях: стандартный и удлиненный протоколы для набора AmpFlSTR Identifiler Plus PCR Amplification Kit («Applied Biosystems», США) и стандартный протокол для набора AmpFlSTR Minifiler PCR Amplification Kit («Applied Biosystems», США), а также модифицированных протоколов амплификации по системе Identifiler Plus с увеличенным количеством циклов до 31 и 34 и температурой завершающего отжига 56 °С [4].

Для очистки продуктов амплификации пользовались набором MinElute PCR Purification Kit (QIAGEN, Германия) и методикой, описанной в инструкции к набору.

Достоверность результатов проверяли путем сравнения с генотипами, установленными ранее по образцам буккального эпителия (далее — референсные генотипы).

Выделение яДНК. В ходе работы сравнили эффективность выделения различными методами для выявления оптимального варианта при исследовании единичного волоса. Всего применили 8 методов выделения яДНК.

Действие 6 способов выделения яДНК основано на способности молекул яДНК селективно сорбироваться на различных носителях, а при изменении условий переходить обратно в раствор. Принципиально такие технологии отличаются этапом очистки высокомолекулярной яДНК от белков, красителей, солей и других примесей, в том числе пигментов волос, которые могут присутствовать в криминалистических образцах и впоследствии ингибировать ПЦР. Использовали следующие наборы реагентов:

— набор PrepFiler Forensic DNA Extraction Kits, комплекс наборов Tissue and Hair Extraction Kit и DNA IQ System, а также набор М-сорб. яДНК сорбируется на магнитных частицах;

— наборы QIAamp DNA Investigator Kit, QIAamp DNA MicroKit и innuPREP Forensic Kit. яДНК сорбируется на мембране колонок.

В составе лизирующего буфера из специализированного набора Tissue and Hair Extraction Kit содержатся протеиназа К и дитиотрейтол, что позволяет разрушить кератинизированные ткани волоса. Длительность и температура инкубации составляют 1 ч и 56 °C соответственно.

Набор PrepFiler Forensic DNA Extraction Kits предназначен для работы с широким спектром объектов, лизис производится с добавлением дитиотрейтола. Рекомендуемые условия: температура от 50 до 80 °C, продолжительность от 10 до 90 мин. Основной режим: температура 70 °C, продолжительность 40 мин.

Реагенты фирм QIAGEN и «Analytic Jena AG Life Science» разработаны для получения препаратов яДНК из различного биоматериала, в том числе из волос. Набор QIAamp DNA MicroKit рекомендован для работы с микроколичествами биологического материала и содержит реагент для более эффективного связывания молекул яДНК. Лизис проходит при добавлении дитиотрейтола и протеиназы К. Инкубация по методикам фирмы QIAGEN: температура 56 °C, длительность 1 ч, фирмы «Analytic Jena AG Life Science» — соответственно 50 °C, до 2 ч.

Набор отечественного производства М-сорб, согласно инструкции, предназначен для выделения яДНК из клинических образцов (кровь и буккальный эпителий). Продолжительность лизиса составляет от 15 до 30 мин при температуре 60 °C.

Дополнительно опробовали набор Arcturus PicoPure DNA Extraction Kit, предназначенный для выделения яДНК из нескольких клеток после микродиссекции. Выделение яДНК происходит в одну стадию без очистки препарата. Лизис проводят в буферном растворе в присутствии протеиназы в течение 3 ч при температуре 65 °C. Положительным моментом такой методики является отсутствие неизбежных потерь яДНК при многоэтапном процессе. Очистку препарата яДНК не проводят, поэтому в растворе могут остаться ингибиторы яДНК-полимеразы.

Те же достоинства и недостатки имеет метод выделения яДНК с использованием ионообменной смолы Chelex 100 Resin («Bio-Rad Laboratories», США).

В ходе выделения всеми методами получили 50 мкл препарата ДНК.

На основании данных цитоморфологического исследования и количественной оценки препаратов яДНК сделали следующие рекомендации по выделению яДНК:

1. Волосы с количеством ядер в луковице до 10. Содержание яДНК в препарате составило менее 0,01 нг/мкл независимо от метода выделения яДНК. Объединение нескольких таких волос со сходными морфологическими признаками не приводит к возрастанию количества выделенной яДНК. Данные волосы полностью непригодны для молекулярно-генетического исследования.

2. Волосы с количеством ядер в луковице от 10 до 100. Более высокое содержание яДНК отметили для препаратов, полученных при использовании наборов Arcturus PicoPure DNA Extraction Kit, PrepFiler Forensic DNA Extraction Kit, комплекса наборов Tissue and Hair Extraction Kit и DNA IQ System, наборов фирмы QIAGEN.

Для выделения яДНК из волос 2-й и 4-й групп не рекомендуется использовать наборы DNA IQ System (без дополнительных реагентов, входящих в состав Tissue and Hair Extraction Kit), innuPREP Forensic Kit, М-сорб и Chelex 100 Resin.

3. Если количество ядер в корневой части волоса около 100 и более, то пригоден любой из способов выделения яДНК. Экспериментально показано, что все препараты, полученные из таких волос, содержали более 0,05 нг/мкл яДНК.

Генотипирование. Выбор подходов к генотипированию волос зависит от результатов цитологического исследования и количественной оценки выделенной яДНК.

По итогам работы определили нижний предел содержания яДНК в препарате, при котором целесообразно продолжать исследование, — 0,01 нг/мкл.

Препараты, полученные из волос с количеством ядер 10—100, в зависимости от количества яДНК можно условно разделить на две группы: содержащие более 0,05 и менее 0,05 нг/мкл яДНК.

При содержании яДНК в препарате более 0,05 нг/мкл генотипирование следует проводить по стандартному протоколу Identifiler Plus. Полученные генетические профили характеризуются интенсивностью сигнала выше 500 RFU. При сравнении полученных данных с референсными генотипами отметили полное их соответствие. Такие результаты не нуждаются в особых рекомендациях по интерпретации.

Генотипирование препаратов с количеством яДНК менее 0,05 нг/мкл необходимо проводить по удлиненному протоколу Identifiler Plus 29 циклов. Рекомендуемый предел определения аллеля составляет 50 RFU, что обеспечивает, с одной стороны, более чем троекратное превышение фонового сигнала, а с другой — минимизирует риск выпадения аллеля. В условиях недостаточного количества матричной яДНК необходимо всегда учитывать возможность появления стохастических эффектов. Дисбаланс интенсивности сигнала между короткими и длинными локусами указывает на частичную деградацию яДНК либо ее недостаточное количество. Несбалансированная амплификация длинных фрагментов (более 200 н.п.) может привести к выпадению аллеля, т. е. неполной амплификации. Сильный сигнал от статтора или неспецифическая амплификация, наоборот, внесут в генотип аллель-артефакт. Такие результаты не могут считаться достоверными при постановке единичной амплификации. В связи с этим следует повторить амплификацию по удлиненному протоколу Identifiler Plus 29 циклов и протоколу Minifiler. По нашим данным, в таких случаях оптимальной следует считать постановку трех параллельных амплификаций с последующим сравнением результатов (рис. 1, на

В ходе работы установили, что типирование мини-STR-локусов позволяет значительно улучшить результаты. Система Minifiler, разработанная для исследования частично деградированной яДНК, продемонстрировала хорошие результаты при генотипировании образцов с недостаточным количеством яДНК, полученных из единичных волос (рис. 2, на

Другие методы оптимизации генотипирования образцов с содержанием яДНК менее 0,05 нг/мкл, а именно увеличение количества циклов амплификации и очистка амплификатов, не привели к ожидаемому повышению эффективности генотипирования.

При использовании амплификации по модифицированным протоколам по панели Identifiler Plus отметили множественные стохастические эффекты. Корректно провести анализ и установить генотип оказалось невозможно.

Применение набора MinElute PCR Purification Kit для очистки амплификатов усилило общую интенсивность сигнала, однако достичь улучшения качества профиля не удалось. Происходило усиление «засветки». Выявить истинные аллели при неполной амплификации не удавалось, сохранялся дисбаланс гетерозигот.

По итогам апробации можно сделать заключение, что использование данных модифицированных протоколов и очистка амплификатов нецелесообразны.

Следует особо отметить, что к оценке данных, полученных при генотипировании яДНК в количестве менее 0,02 нг/мкл, необходимо подходить с осторожностью, а результаты приводить с пояснениями, показывающими ограниченную пригодность таких генетических профилей для сравнительного исследования. На основании таких результатов правомерно делать следующие заключения: при несовпадении генетических характеристик — категорический отрицательный вывод; при совпадении генетических характеристик — вероятный вывод о том, что происхождение образцов от одного и того же лица не исключается.

По итогам проведенной работы представлены методики прогностического скрининга и оптимизации молекулярно-генетического исследования волос человека. Информация о фазе роста исследуемого волоса, состоянии эпителиальных тканей и количестве ядер в корневом конце, соотнесенная с данными количественного определения ДНК в препарате, позволяет спланировать эффективную тактику генотипирования, предусмотреть возможные проблемы и пути их решения (рис. 3, на

Внедрение предложенного алгоритма исследования волос человека, по нашему мнению, будет способствовать получению достоверных результатов, исключению ложноотрицательных выводов и в целом производству экспертиз на более высоком уровне.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

*e-mail: lареnkov@rc-sme.ru; https://orcid.org/0000-0002-5700-7292

¹1-я часть комплексной работы по развитию и совершенствованию экспертного исследования волос человека опубликована в №1 2019 г.