Основные задачи судебно-химического исследования (экспертизы) — СХИ/Э — идентификация и количественное определение важных с токсикологической точки зрения веществ в биологических тканях и жидкостях человека, а также в объектах небиологического происхождения. Данные исследования относятся к области лабораторных. Согласно современной концепции, в процессе лабораторного исследования выделяют три этапа:
— преаналитический (доаналитический);
— аналитический;
— постаналитический [1].
Преаналитический этап включает следующее:
— выбор и назначение исследования врачом судебно-медицинским экспертом (сотрудником судебно-следственных органов);
— отбор биоматериала (небиологических объектов);
— выбор посуды для отбора объектов;
— маркировка объектов для анализа;
— транспортировка объектов в судебно-химическое отделение;
— регистрация объектов в отделении;
— распределение объектов по назначенным видам исследований.
Аналитический этап — это комплекс необходимых для выполнения исследования аналитических процедур, объединенных методикой исследования и завершающихся получением качественной или количественной оценки. Основные этапы методик СХИ/Э заключаются в выделении токсиканта из биоматериала, его идентификации по химической структуре (масс-спектрометрические методы) или на основе детекции его специфических свойств (хроматографические методы с детекцией веществ по поглощению в УФ-области спектра, флюоресценция, теплопроводность и т. д.) с последующей количественной оценкой. Регистрация результатов СХИ/Э должна исключать субъективную оценку и основываться только на объективной (приборная) оценке.
Постаналитический этап включает внутрилабораторную фазу. В этой фазе судебный эксперт-химик устанавливает аналитическую достоверность (по данным лабораторного контроля качества) и биологическую вероятность (правдоподобие) результатов исследования с учетом всех обстоятельств назначения СХИ/Э.
В судебно-химическом отделении существует система контроля качества на всех этапах СХИ/Э. Ответственным за контроль качества на этапах исследований является заведующий отделением, для каждого вида контроля определены ответственные лица и документация.
Контроль качества на преаналитическом этапе включает следующее: стандартизацию отбора проб (одноразовая посуда, стандартные этикетки для маркировки, инструкция по отбору биоматериала в зависимости от цели СХИ/Э, обеспечение условий для хранения биоматериала до отправки в судебно-химическое отделение и условий для транспортировки — сумки-холодильники); входящий контроль объектов и документации в отделении для идентификации объектов с направлениями на исследование; входящий контроль реактивов, лабораторной посуды и расходных материалов для оборудования. Все химические реактивы, используемые в отделении, проходят входящий контроль при поступлении в лабораторию не только по параметрам, приведенным в паспорте качества, но и по методикам пробоподготовки, используемым в лаборатории. Для этого проводят пробоподготовку «холостой» пробы, включая все стадии, в том числе анализ методом газовой хроматографии масс-спектрометрии (ГХ-МС). Затем соответствующую запись заносят в «Журнал контроля качества химических реактивов». Определенную процедуру проводят с каждой партией химической посуды и делают запись в «Журнале контроля чистоты химической посуды».
Начинают СХИ/Э с заполнения технологической карты, в которой указывают пол, возраст трупа, обстоятельства дела, перечень объектов, доставленных на исследование, их количество. Судебный эксперт (химик) отмечает виды пробоподготовки, которые необходимо провести с объектами анализа, и передает карту лаборанту. После выполнения пробоподготовки карту вместе с подготовленными пробами передают в соответствующую лабораторию. По окончании исследования судебный эксперт (химик) вносит в карту результат анализа каждой пробы. Повторные исследования также отмечают в технологической карте. В ней обязательно указывают даты направления объектов для проведения пробоподготовки, окончания пробоподготовки, анализа на приборах и обработки хроматограмм.
Таким образом, технологическая карта позволяет в сжатом виде получить полную информацию о проведенных анализах, полученных результатах и сроках их выполнения; оценить качество пробоподготовки биообъектов по повторным пробоподготовкам, постоянно контролировать сроки по датам выполнения каждого этапа СХИ/Э.
Контроль качества на аналитическом этапе рассмотрим на примере лаборатории масс-спектральных методов анализа как основного метода идентификации и количественного определения наркотических средств, психотропных и сильнодействующих веществ. Общеизвестны и неоспоримы положительные стороны данного метода: низкие пределы обнаружения, возможность идентификации веществ по библиотекам масс-спектров, широкий спектр идентифицируемых веществ (ограничен только массой молекулы вещества и наличием масс-спектра в библиотеке), возможность идентификации практически неограниченных компонентов смеси и т. д. В условиях применения метода как скринингового при ежедневном анализе большого объема проб качество пробоподготовки биообъектов для анализа становится основной стадией риска для получения достоверного результата. Автоматический ввод пробы и возможности программного обеспечения по контролю технического состояния хромато-масс-спектрометров обеспечивают объективную оценку качества анализа пробы на приборе. В то же время пробоподготовка, как правило, многостадийная, включает большой объем ручного труда; биологические объекты значительно различаются по своему состоянию в зависимости от давности и обстоятельств наступления смерти. Несоблюдение рН, температурного режима, длительности отдельных процедур (экстракция, центрифугирование) может привести к потере целевого аналита, и как следствие, к ложноотрицательному результату.
Все эти обстоятельства делают стадию пробоподготовки критической для получения достоверных результатов СХИ/Э и требуют разработки соответствующих подходов к ее контролю. Все методики пробоподготовки в судебно-химическом отделении оформлены в виде стандартных операционных процедур.
На стадии отбора проб (кровь, моча) добавляют внутренний стандарт как для контроля пробоподготовки, так и для количественных определений идентифицированных веществ. Проведение исследований с добавлением внутреннего стандарта — основное требование качества СХИ/Э. Только оценка результатов анализа на присутствие (в ряде случаев и количественная оценка) токсиканта позволяет гарантировать правильность проведения пробоподготовки, т. е. соблюдения всех необходимых условий для изолирования целевого аналита из биологической пробы, и сделать выводы о его наличии или отсутствии в пробе.
При производстве СХИ/Э неизвестно, какие вещества могут содержаться в пробе. Именно поэтому, чтобы вещество могло быть использовано в качестве внутреннего стандарта, оно должно обладать рядом свойств:
1) не содержаться в пробе;
2) иметь близкие физико-химические свойства к целевому аналиту (изолироваться из биоматериала по той же методике, что и аналит);
3) подвергаться дериватизации (если по методике аналит определяется в виде дериватов);
4) иметь близкие хроматографические свойства (относительно близкое время удерживания на хроматографических колонках);
5) иметь близкий по m/z целевой ион по отношению к аналиту (для ГХ-МС);
6) быть устойчивым в виде растворов [2].
Для методики количественного определения морфина в качестве внутреннего стандарта можно использовать налтрексон, обладающий всеми перечисленными свойствами. Налтрексон — лекарственное средство, антагонист опиоидных рецепторов. В организме человека полностью метаболизируется в печени с образованием метаболитов и в нативном виде в крови не определяется, что исключает необходимость контрольного исследования проб крови на отсутствие данного вещества. Налтрексон имеет сходную с морфином структуру и, следовательно, физико-химические, хроматографические (относительное время удерживания морфина по отношению к налтрексону 0,839) свойства. Он дериватизируется как морфин с образованием 2ТМС-производных и образует целевой ион (m/z 485), близкий к целевому иону морфина (m/z 429).
Одним из самых сложных и важных вопросов посмертной аналитической токсикологии является количественное определение ксенобиотиков в крови. Только результаты такого определения могут служить основанием для вынесения объективного заключения о причине смерти или о степени влияния идентифицированных веществ на состояние человека. Сложность исследования посмертной крови заключается в том, что по сравнению с плазмой, сывороткой и особенно с мочой в пробе крови имеется большое количество эндогенных веществ (например, жирные кислоты, холестерол и другие стеролы). В связи с этим пробоподготовка становится критической стадией при анализе крови и требует постоянного контроля для получения надежных результатов. В соответствии с приказом Минздравсоцразвития РФ № 346 «Об утверждении Порядка организации и производства судебно-медицинских экспертиз в государственных судебно-экспертных учреждениях Российской Федерации» все методы количественного определения должны быть апробированы на той биологической матрице, которая будет использоваться для анализа (кровь, моча, ткани органов), к которой добавляют заведомо известное количество вещества и подвергают исследованию по данной схеме анализа.
В качестве примера выполнения данного требования проводили методику ежедневного контроля исследований посмертной крови с целью определения наркотических средств группы опиатов. Ежедневный контроль пробоподготовки крови проводят с помощью образцов трупной крови с заведомо известной концентрацией морфина. Технология приготовления стандартных образцов крови: трупную кровь (в достаточном объеме) исследуют методом ГХ-МС на отсутствие токсичных веществ. При отрицательном результате анализа отбирают пробы крови объемом 2 мл, помещают в стеклянные флаконы, в которых будет проводиться пробоподготовка, добавляют расчетное количество раствора морфина гидрохлорида для получения концентраций морфина в крови 0,18, 0,89 и 1,79 мг/л. Пробы укупоривают и помещают на хранение в морозильную камеру при температуре –18 °С. По нашим данным, образцы крови, содержащие морфин, стабильны при хранении в течение не менее 7 мес.
Аналогичным способом готовят пробы биотканей. Технология приготовления стандартных образцов биотканей: биоткань печени (в достаточном объеме) исследуют методом ГХ-МС на отсутствие токсичных веществ. При отрицательном результате анализа биоткань мелко измельчают, отбирают пробы, соответствующие по массе одному анализу. Пробы помещают в стеклянные флаконы, в которых будет проводиться пробоподготовка. К каждой пробе добавляют расчетное количество целевого аналита, пробы тщательно укупоривают и помещают на хранение в морозильную камеру при температуре –18 °С. Ежедневно необходимое количество стандартных образцов крови анализируют одновременно с поступившими на исследование пробами по методике, включающей все стадии пробоподготовки и количественного определения. Схема анализа серии проб включает анализ положительной пробы и отрицательной пробы, затем выполняют хроматографирование анализируемых проб, в середине серии (при количестве проб более 15) — анализ положительной и отрицательной проб, в конце серии — также анализ положительной и отрицательной проб. Требования к точности приготовления стандартных проб, оценке результатов анализа и документальному оформлению определяют принятой в лаборатории политикой качества.
Предлагаемый подход к контролю качества позволяет:
— готовить стандартные пробы раз в несколько месяцев;
— контролировать стабильность внутреннего стандарта;
— ежедневно контролировать все стадии анализа без значительных материальных затрат;
— готовить стандартные пробы индивидуально для каждой лаборатории с учетом необходимого диапазона концентрации и объема проб;
— готовить стандартные пробы любых веществ, необходимых для лаборатории.
Основное ограничение данного метода: целевой аналит должен быть стабилен при хранении в крови при температуре –18 °С.
Для контроля пробоподготовки скрининговых проб мочи можно использовать контрольные образцы мочи: например, лиофилизированные стандарты Medidrug (Германия), содержащие набор целевых веществ в концентрации ±25% cut-off. Перед началом анализа лиофилизированный образец реконструируют точным объемом очищенной воды и получают образец мочи с точно известной концентрацией целевых аналитов. При анализе данных образцов лаборатория может использовать свой объем пробы, свои методики пробоподготовки и методы анализа. Основная задача — идентифицировать в образце целевые аналиты с заданным пределом cut-off. Использование подобных образцов целесообразно как для внутреннего контроля качества исследований в судебно-химической лаборатории, так и для межлабораторных сличений, особенно при повторных исследованиях одной пробы.
Для всего спектра токсикологически значимых веществ невозможно использовать контрольные материалы при скрининговых исследованиях. В связи с этим для качества СХИ/Э важны метрологическая поверка оборудования и контроль за его техническим состоянием.
Контроль качества на постаналитическом этапе включает:
а) анализ полученного результата экспертом-химиком;
б) контроль результатов ответственными экспертами по методам исследований;
в) выпускной контроль.
При анализе полученного результата эксперт-химик оценивает достоверность полученного результата, соответствие обнаружения целевых аналитов в различных биологических жидкостях и тканях (от одного человека), наличие или отсутствие метаболитов, возможность артефактов (образование веществ при проведении пробоподготовки) и т. д. Особого внимания требует обоснование выводов о необнаружении токсикантов в биологических объектах. Для подобных выводов необходимо учитывать соответствие пробоподготовки физико-химическим свойствам целевого аналита, возможность идентификации аналита выбранным методом анализа, пределы обнаружения методик определения, данные по токсикокинетике, метаболизму, сохраняемости.
Важное значение имеет контроль результатов ответственными экспертами по методам исследований. На данном этапе прежде всего контролируют обоснованность выводов об определении или неопределении токсикантов в биологических объектах путем оценки качества хроматографической информации, соответствия всего исследования стандартам производства СХИ/Э, принятым в Бюро.
Выпускной контроль осуществляет заведующий судебно-химическим отделением. Его задача — оценка соответствия результатов, полученных разными методами исследований.
Идентификация ксенобиотиков в биологических объектах является достаточно сложной аналитической задачей. Постоянно меняющийся спектр токсикантов, появление новых наркотических средств и психотропных веществ, необходимость анализа биологических объектов различной степени сохранности, процессы перераспределения токсикантов в теле человека после наступления смерти, процессы новообразования и окисления токсикантов в биологических пробах при хранении создают значительные трудности как при проведении СХИ/Э, так и при интерпретации полученных результатов. Стандартизация и контроль на всех этапах — залог получения достоверных и воспроизводимых результатов СХИ/Э.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
*e-mail: Tv-gorbacheva@yandex.ru; https://orcid.org/0000-0003-2246-0270