2-Метокси-4-(1-пропенил)гидроксибензол [син.: 2-метокси-4-(проп-1-ен-1-ил)фенол (ИЮПАК), 2-метокси-4-(1-пропенил)фенол, 2-метокси-4-пропенилфенол, 3-метокси-4-гидрокси-1-пропен-1-илбензол, 1-(3-метокси-4-гидроксифенил-1-пропен), 4-гидрокси-3-метоксипропенил-бензол, 4-пропенилгваякол, пропенилгваякол, изоэвгенол], в дальнейшем 2-МО-4-(1-П)ГОБ (мол. масса 164,204) — биологически активное соединение, оказывающее антиоксидантное и антисептическое действие [1].

Самостоятельно и в виде комбинаций с другими веществами 2-МО-4-(1-П)ГОБ применяют в качестве противомикробного средства для поддержания свежести пищевых продуктов [2]. Он также является полупродуктом химического и биотехнологического синтеза ванилина [3].

2-МО-4-(1-П)ГОБ может быть трансформирован в ванилин с помощью штаммов ряда бактерий, например Bacillus fusiformis и Pseudomonas putida IE27, а также под воздействием фермента, выделяемого из сои [4—6].

2-МО-4-(1-П)ГОБ представляет собой вязкую прозрачную, слегка желтоватую жидкость с характерным гвоздичным запахом; температура кипения 140—145 °С, температура застывания 15—20 °С.

Данное соединение плохо растворяется в воде и глицерине, хорошо растворимо в низших одноатомных спиртах (метанол, этанол, пропанол), галогеналканах (дихлорметан, хлороформ), простых и сложных эфирах (этоксиэтан, метилацетат, этилацетат), ацетоне, диоксане, ацетонитриле [1, 7, 8].

2-МО-4-(1-П)ГОБ способен к фотохимическому и фотокаталитическому окислению с образованием дегидродиизоэвгенола. Предположительно это происходит по радикальному ступенчатому механизму окислительной димеризации.

Вещество обладает токсическими свойствами в отношении теплокровных организмов. LD₅₀ 2-МО-4-(1-П)ГОБ при пероральном введении его крысам составляет 1560 мг/кг, морским свинкам — 1410 мг/кг, при интраперитонеальном введении мышам 328 мг/кг. В соответствии с приводимыми токсикометрическими данными вещество можно отнести к умеренному уровню опасности. Выявлено сенсибилизирующее и раздражающее действие данного вещества для животных и человека [9—11]. Описаны случаи отравления отдельными алкенилгидроксиаренами и их смесями, включающими изоэвгенол, различной степени тяжести; зафиксированы даже летальные исходы [12—14].

Наличие у 2-МО-4-(1-П)ГОБ токсических свойств, применение данного вещества в различных отраслях промышленности, случаи летального отравления фенольными смесями, включающими 2-МО-4-(1-П)ГОБ, обусловливают интерес к нему как к потенциальному объекту химико-токсикологического исследования. В судебно-химическом отношении 2-МО-4-(1-П)ГОБ изучен мало. В частности, недостаточно ясен характер распределения вещества в теплокровных организмах после введения его в дозах, приводящих к отравлениям с летальным исходом.

Цель исследования — изучение характера распределения 2-МО-4-(1-П)ГОБ в организме теплокровных (крысы) при введении трехкратной LD₅₀.

В качестве объекта исследования рассмотрен 2-метокси-4-(1-пропенил)гидроксибензол [2-МО-4-(1-П)ГОБ) (CAS No. 97−54−1; фирма «Fluka», Швеция)], содержание основного вещества не менее 98%.

Подопытными животными служили крысы-самцы 4-месячного возраста линии Wistar. Исследования проводили по методикам, применяемым при изучения распределения отдельных гидроксиароматических соединений [15, 16].

В процессе исследования сформировали 6 групп подопытных животных — 5 опытных и контрольную (по 5 особей с массой тела 135—150 г в каждой). Каждому животному опытных групп с помощью зонда вводили в желудок 2-МО-4-(1-П)ГОБ в количестве, соответствующем тройной LD₅₀ (3×1560 мг/кг). Введение подобной дозы обеспечивало гарантированную гибель 100% особей, входивших в экспериментальные группы. Животные погибали в течение 1,5—2 ч после введения отравляющего вещества. Затем трупы животных вскрывали, одинаковые органы и биожидкости, взятые от особей внутри каждой из групп, объединяли и исследовали на присутствие в них 2-МО-4-(1-П)ГОБ.

Изолирование. Ткань того или иного органа после измельчения до частиц размером 0,2—0,5 см или биожидкость настаивали 2 раза с порциями этилацетата, масса каждой из которых превышала массу биоматериала в 2 раза. Настаивание осуществляли в условиях периодического перемешивания в течение 45 мин. Отдельные извлечения объединяли в фарфоровой чашке и испаряли растворитель из объединенного извлечения в токе воздуха при температуре 18—22 °С до объема 0,5—1,0 мл, а затем в токе азота удаляли остатки растворителя и получали сухой остаток.

Очистка. Сухой остаток, полученный в результате удаления растворителя из объединенного извлечения, обрабатывали 1,0—1,5 мл системы органических растворителей гексан-диоксан (7:3). Образовавшийся раствор наносили на поверхность столба силикагеля L 40/100 мкм массой 10 г в колонке размером 490×11 мм. После того как раствор полностью входил в слой сорбента, в колонку начинали добавлять элюент—гексан-диоксан (7:3). Вытекающий из колонки элюат собирали фракциями по 2 мл каждая в отдельные пробирки. Анализируемое вещество обнаруживали во фракциях путем нанесения незначительных объемов (5—10 мкл) каждой из них на хроматографическую пластину типа Сорбфил ПТСХ-АФ-А-УФ и хроматографирования одновременно с веществом-свидетелем в стеклянных цилиндрических камерах вместимостью около 600 см³; в качестве подвижной фазы смеси использования растворителей гексан-ацетон (9,5:0,5). Хроматограммы проявляли путем облучения УФ-лучами (λ=254 нм). Присутствие 2-МО-4-(1-П)ГОБ в отдельных фракциях определяли по наличию на хроматограмме пятен с величиной Rf, совпадающей с таковой у вещества-стандарта (0,36±0,04). Фракции элюата, в которых обнаруживали 2-МО-4-(1-П)ГОБ (в стандартных условиях с 4-й по 8-ю (7—16 мл), сливали в одну фарфоровую чашку и испаряли растворитель из объединенного извлечения в токе воздуха при температуре 18—22 °С до объема 0,5—1,0 мл, а затем в токе азота удаляли остатки растворителя и получали сухой остаток. Данный остаток растворяли в 5—7 мл этилацетата, количественно переносили в мерную колбу вместимостью 10 мл и доводили до метки этилацетатом (исходный раствор).

В фарфоровые чашки № 1 и № 2 помещали по 1—5 мл исходного раствора, растворитель из порций раствора в обеих чашках испаряли в токе азота до получения сухого остатка.

Идентификация с использованием ТСХ. Остаток, находящийся в чашке № 1, растворяли в незначительном количестве ацетона и количественно переносили на линию старта пластины «Сорбфил» ПТСХ-АФ-А-УФ в виде полосы. На линию старта этой же пластины наносили 5—10 мкл раствора (0,08% в этаноле) стандарта 2-МО-4-(1-П)ГОБ (вещество—свидетель). Проводили хроматографию, используя в качестве элюента систему органических растворителей гексан-ацетон (9,5:0,5). Хроматограммы проявляли, облучая их поверхность УФ-лучами (λ=254 нм). Анализируемый аналит идентифицировали по величине абсолютной хроматографичекой подвижности (Rf).

Идентификация с использованием УФ-спектрофотометрии. После идентификации с помощью ТСХ из хроматограммы вырезали участок с пятном исследуемого вещества, помещали его в пробирку и элюировали аналит 5 или 10 мл этанола в течение 10 мин, перемешивая содержимое пробирки через каждые 2—2,5 мин. Часть полученного элюата сливали в кювету и исследовали его светопоглощение в области «кварцевого» ультрафиолета (интервал 200—360 нм). Измерение оптической плотности проводили с помощью спектрофотометра СФ-2000 в кюветах с толщиной рабочего слоя 10 мм. Если оптическая плотность (о.п.) в области наиболее длинноволнового максимума превышала 1,1 ед. о.п., элюат разбавляли этанолом.

Идентификация с использованием ВЭЖХ. Остаток в чашке № 2 растворяли в 2 мл ацетонитрила, к полученному раствору добавляли 2 мл буферного раствора pH 5,5 (0,04 М CH₃COONH₄, CH₃COOH). Затем 20 мкл полученного раствора вводили в хроматограф LC-20 Prominance («Shimadzu», Япония) с матричным фотодиодным детектором УФ- и видимого спектров (SPD-M20A). Хроматографировали в изократическом режиме, используя колонку размером 250×4,6 мм Discovery C18 HPLC Column 5 мкм (Supelco) с предколонкой размером 20×4,0 мм Discovery C18 Supelguard Guard Cartridge Kit, 5 мкм (Supelco). Температуру термостата колонки поддерживали на уровне 40 °C. Подвижная фаза – ацетонитрил-ацетатный буферный раствор pH 5,5 (0,04 М CH₃COONH₄, CH₃COOH) (50:50). Скорость потока подвижной фазы составляла 1 мл/мин. Оптическую плотность регистрировали при λ =260 нм.

Исследуемое вещество идентифицировали по специфическому времени удерживания.

Количественное определение. Исходя из величины оптической плотности этанольного элюата, соответствующей максимуму длинноволновой полосы поглощения 261 нм, рассчитывали количественное содержание 2-МО-4-(1-П)ГОБ методом УФ-спектрофотометрии.

При идентификации с помощью ТСХ в предлагаемых условиях получили хроматограммы, на которых анализируемое вещество проявлялось в УФ-лучах в виде темных пятен с Rf– 0,36±0,04, что соответствовало величине Rf стандарта 2-МО-4-(1-П)ГОБ.

Спектральные кривые (растворяющая среда — этанол) отражают характер поглощения УФ-излучения стандартом 2-МО-4-(1-П)ГОБ и этим же веществом, выделенным из ряда органов крыс (рис. 1).

По этой схеме исследовали органы и биожидкости животных контрольной группы, которые не получали 2-МО-4-(1-П)ГОБ. Установили отсутствие данного вещества в извлечениях из тканей органов и крови животных. Фоновое поглощение этанольных элюатов из участков хроматограмм, по площади и положению соответствующих анализируемому веществу, при аналитической длине волны 261 нм составляло не более 0,032 ед. о.п. (извлечения из органов) и 0,025 ед. о.п. (извлечение из крови) в пересчете на 5 г той или иной биоматрицы.

На рис. 2 приведены

Проведенные исследования показали, что при идентификации с помощью ВЭЖХ время удерживания 2-МО-4-(1-П)ГОБ, извлеченного из биологических объектов, совпадает со временем удерживания вещества—стандарта и составляет 6,87±0,08 мин.

На хроматограммах исследуемого соединения, полученных с использованием ВЭЖХ, в области, соответствующей интервалу времени удерживания 6,5—7,5 мин, отсутствуют (по сравнению с хроматограммой вещества-стандарта) дополнительные пики и существенное смещение базовой линии.

Линейная зависимость оптической плотности этанольных растворов 2-МО-4-(1-П)ГОБ (измерение при λ =261 нм) от содержания в них анализируемого вещества соответствует интервалу концентраций 0,5—10 мкг/мл. Данная зависимость описывается уравнением прямой линии, имеющей вид: А = 0,110175∙С–0,0172085, где А — оптическая плотность, С — концентрация анализируемого вещества в фотометрируемом растворе (в микрограммах в 1 мл). Коэффициент корреляции составляет 0,99949.

При определении 2-МО-4-(1-П)ГОБ в субстанции методом УФ-спектрофотометрии стандартное отклонение составило 0,861, относительное стандартное отклонение 0,859, относительная ошибка среднего 0,902% (n=6; p=0,95).

Результаты количественного определения 2-МО-4-(1-П)ГОБ в органах и крови отравленных животных, отражающие особенности распределения данного соединения у теплокровных (крысы), представлены в таблице.

Из данных таблицы видно, что 2-МО-4-(1-П)ГОБ присутствует в неизмененном виде как в органах, так и в крови погибших животных. Согласно полученным результатам, исследованное соединение в 100 г органа или биожидкости обнаруживали в большем количестве в желудке с содержимым (236,22±28,21 мг), тонкой кишке с содержимым (122,29±15,55 мг), легких (44,28±4,10 мг) и селезенке (44,00±4,70 мг), в несколько меньших количествах — в почках (28,55±2,53 мг), в сердце (26,56±1,86 мг) и мышцах (19,43±1,12 мг) отравленных животных.

1. Исследовали распределение 2-метокси-4-(1-пропенил)гидроксибензола у теплокровных животных (крысы) после однократного внутрижелудочного введения тройной LD₅₀ вещества.

2. Установили, что вещество обнаруживается в неизмененном виде во всех подвергнутых исследованию органах и крови отравленных животных.

3. Отметили присутствие наиболее значительных количеств 2-метокси-4-(1-пропенил)гидроксибензола в 100 г биологического объекта: в желудке с содержимым (236,22±28,21 мг), тонкой кишке с содержимым (122,29± 15,55 мг), легких (44,28±4,10 мг) и селезенке (44,00±4,70 мг).

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

²e-mail: apa2004@mail.ru;
https://orcid.org/0000-0001-7002-492X;

³e-mail: chem_pharm@list.ru;
https://orcid.org/0000-0001-8414-1756