В практике врача судебно-медицинского эксперта наибольшую сложность представляют клинические случаи с тяжелой мозговой симптоматикой, на вскрытии не имеющие макроскопических признаков повреждения костных структур и ткани мозга, иногда сопровождающиеся мелкими периваскулярными кровоизлияниями в белом веществе мозга. Подобные состояния часто отмечаются вследствие черепно-мозговой травмы (ЧМТ). Изменения аксонов при этом выявляют в мозолистом теле, внутренней и наружной капсулах мозга, структурах ствола мозга. Данные состояния выделены в отдельную группу, названную диффузным аксональным повреждением (ДАП).
Причиной повреждения аксонов служит их перерастяжение с разрывом клеточного аппарата, вызванное смещением мозговых структур относительно друг друга, что часто происходит при травмах с ротационным механизмом. К таким травмам прежде всего относятся дорожно-транспортные происшествия и спортивные травмы. Частота ДАП составляет 28—55% от всей тяжелой ЧМТ, а летальность 47—70% [1].
При повреждении нервной ткани и возникновении последующих реакций образуется широкий спектр белков, в том числе астроцитарных. Наибольшее распространение получила иммуногистохимическая (ИГХ) диагностика белков, выделяющихся из нейрона при его повреждении. Один из самых чувствительных и поэтому наиболее широко применяющийся метод — выявление β-APP белка. Этот белок принимает участие в формировании ткани мозга [2]. В нормально функционирующих нейронах белок только транспортируется, не накапливается и никогда не выявляется на тканевом срезе. В травмированном нейроне нарушается транспорт аксоплазмы и происходит накопление β-APP белка вплоть до места повреждения. Этот белок выявляется довольно рано, уже через 35 мин после повреждения, и остается видимым при ИГХ-исследовании длительное время — более 1 мес и даже до 99 дней [3].
Цель исследования — выявить и оценить параметры валидности признаков диагностики ДАП.
Материал и методы
В исследование включили 6 пациентов (5 мужчин и 1 женщина в возрасте от 41 года до 75 лет) с ЧМТ. Время наступления смерти после травмы от 2 ч до 15 сут (см. таблицу).
Для полноценного исследования ткани головного мозга с целью выявления повреждения аксонов материал изымали из следующих зон: белое вещество полушарий большого мозга, передний, средний и задний отделы мозолистого тела, подкорковый тракт, внутренняя и наружная капсулы, верхние ножки мозжечка, ножки мозга, мост и продолговатый мозг.
Для определения β-APP белка в целях диагностики ДАП материал фиксировали в 10% нейтральном буферном формалине в течение 24 ч, затем после дегидратации этанолом кусочки заливали в парафин и изготавливали парафиновые срезы толщиной 5 мкм. По стандартному протоколу ИГХ-исследования, после депарафинизации срезов производили демаскировку антигенов в буфере с высоким рН при температуре 95 °C в течение 20 мин, затем инкубировали в течение 60 мин с моноклональными антителами APP («Vector Labs», Великобритания). В качестве системы детекции использовали систему Histofine («Vector Labs», Великобритания). Реакцию визуализировали с помощью диаминобензидина. После регидратации и заключения срезов в синтетический бальзам препараты исследовали в проходящем свете под микроскопом Leica DM4000 В LED с увеличением от 50 до 400. Для изготовления микрофотографий применяли установленную на микроскопе цифровую камеру Leica DFC450C и программное обеспечение LAS v4.5.
Результаты и обсуждение
К традиционному описанию гистологической картины повреждения аксонов относят следующие изменения: наличие ретрагированных (аксональные) шаров, образующихся при разрыве нервного волокна и истечении аксоплазмы, формирующей булавовидное утолщение аксона, в последующем — диффузную дегенерацию нервных волокон по типу валлеровского перерождения [3].
В работе при гистологическом исследовании всей группы препаратов, окрашенных гематоксилином и эозином, выявили неспецифичные для данного вида травмы морфологические изменения: отек вещества, полнокровие сосудов, набухание клеток, перицеллюлярный отек, гиперхромию и увеличение ядер нейронов, исчезновение ядрышек. Аксональные шары не обнаружили. Наблюдали положительную ИГХ-реакцию с антителами к β-APP белку в 2 случаях ЧМТ — во внутренней капсуле, мозолистом теле и продолговатом мозге (рис. 1).
Случай 1. Мужчина, 71 года, диагноз: закрытая ЧМТ: внутримозговая и субдуральная гематомы; выживаемость после травмы 10 сут, давность наступления смерти 2 сут.
Случай 2. Мужчина, 62 лет, диагноз: сочетанная травма, закрытая ЧМТ, субарахноидальное кровоизлияние в левую височно-теменную долю, выживаемость после травмы до суток, давность наступления смерти 2 сут. Интенсивность ИГХ-реакции варьировала от слабого присутствия в цитоплазме нейронов до сильного накопления.
Оценку иммуногистохимически определяемого биомаркера проводили по принципу его отсутствия или наличия в исследуемых препаратах. Оценивали показатель интенсивности окрашивания реакции по 3-балльной системе: 1 — слабая окраска; 2 — умеренная; 3 — выраженная. В исследованных образцах окрашивание отсутствовало или интенсивность его составляла 2 и 3 балла. Вычисляли также процент позитивно окрашенных нейронов от их общего числа в поле зрения с подразделением на 5 градаций: 0 — до 5%, 1 — 6—25%, 2 — 26—50%, 3 — 51—75%, 4 — 76% и более [4].
Интенсивную положительную реакцию (3 балла) обнаружили при 10-суточной выживаемости после травмы (диагноз: закрытая ЧМТ, внутримозговая и субдуральная гематомы) в цитоплазме нейронов внутренней капсулы, мозолистого тела и продолговатого мозга (см. рис. 1). Количество визуализированных нейронов достигало 4-й градации — до 100% нейронов.
Менее интенсивную реакцию (2 балла) наблюдали в цитоплазме нейронов при выживаемости после травмы до 1 сут (диагноз: сочетанная травма, закрытая ЧМТ, субарахноидальное кровоизлияние в левую височно-теменную долю). Положительную визуализацию выявили в препаратах белого вещества полушарий большого мозга и ствола мозга (рис. 2);
В исследуемой группе (6 случаев ЧМТ с давностью наступления смерти не более 2 сут до аутопсии) обнаружили позитивную ИГХ-реакцию (умеренную и выраженную) с антителами к β-APP белку только в 2 случаях с выживаемостью 2 и 10 сут, что можно объяснить механизмом развития травмы. Для накопления β-APP белка в механизм травмы должен быть включен момент скручивания, растяжения или разрыва нервных волокон — аксонов. Это нарушает транспорт белков по аксону, что сопровождается накоплением белка до места поражения; процесс визуализируется ИГХ-реакцией. Соответственно чем сильнее нарушена транспортная функция, тем больше белка накапливается в проксимальных отделах нейронов.
Количество накапливаемого белка зависит от времени выживания после травмы, чем больше прошло времени, тем большее количество белка скопилось в телах нейронов.
При исследовании материала, окрашенного гематоксилином и эозином, не выявили аксональные шары, для образования которых необходим разрыв волокна аксона с последующим излитием цитоплазмы. Результаты морфологического и ИГХ-исследований позволяют сделать выводы, что в данных случаях было только внутреннее повреждение аксона с нарушением аксонального транспорта, но без повреждения мембраны волокна. Полученные результаты еще раз подтверждают один из механизмов повреждения аксонов — неполный разрыв аксона (внутреннее аксональное повреждение).
Выводы
Таким образом, можно сделать предварительный вывод о корреляции интенсивности реакции и количества окрашенных нейронов со временем выживания после травмы и степенью выраженности повреждения аксонов. При смерти, наступившей в течение суток после травмы, реакция была умеренной, с незначительным количеством прореагировавших нейронов. В случае 10-суточной выживаемости реакция была интенсивной, захватывала практически 100% нейронов в поле зрения. Результаты исследования требуют дальнейшего подтверждения на большей выборке.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
2e-mail: shigeev@mail.ru; https://orcid.org/0000-0003-2219-5315;
3e-mail: mail@rc-sme.ru; https://orcid.org/0000-0001-6740-9861