Одним из биологически активных веществ, достаточно широко применяющихся в качестве лекарственного средства в офтальмологической практике и оказывающих м-холинолитическое действие, является 2-(диметиламино)этил-(1-гидроксициклопентил)(фенил)ацетат [синонимы: циклопентолат, 2-(диметиламино)этиловый эфир альфа-(1-гидроксициклопентил)-бензолуксусной кислоты; торговые наименования: цикломед, циклоптик; далее циклопентолат] [1—3].

Циклопентолат (брутто-формула основания С₁₇Н₂₅NO₃) — прозрачные кристаллы с коричневатым оттенком или густая жидкость с появляющимся при стоянии характерным запахом; плохо растворим в воде (0,15 г в 100 мл воды), хорошо растворим в ацетоне, хлороформе и этаноле. Гидрохлорид циклопентолата — белый кристаллический порошок с температурой плавления 134—136 °С, хорошо растворимый в воде, растворимый в метаноле и этаноле, нерастворимый в эфире [3, 4].

Циклопентолат обладает определенными токсическими свойствами по отношению к теплокровным организмам. Так, LD₅₀ гидрохлорида циклопентолата составляет при пероральном введении для крыс 4000 мг/кг, для мышей 960 мг/кг; 314 мг/кг при интраперитонеальном и 63 мг/кг при внутривенном путях введения.

Передозировка или ошибочный прием циклопентолата внутрь человеком обычно сопровождается расширением зрачка с возможным отсутствием реакции на свет, сухостью кожного покрова и слизистых оболочек, тахикардией, головокружением, двигательным возбуждением, нарушением отдельных психических реакций. Последствиями длительного применения данного вещества являются тошнота, рвота, атаксия, слабость и дрожь.

Попадание в организм значительных количеств циклопентолата может привести к спазмам дыхательной мускулатуры и развитию коматозного состояния с возможным летальным исходом [5—7].

Описан летальный случай отравления циклопентолатом при медицинском применении вследствие кровоизлияния в средний мозг [8].

Возрастающее в последнее время значение циклопентолата как объекта химико-токсикологического исследования обусловлено прежде всего повышенным интересом к нему наркозависимых людей. Они вводят данное соединение в организм в завышенных дозах интраназально и перорально для достижения одурманивающего эффекта (зрительные и слуховые галлюцинации, изменение эмоционального состояния, иногда состояние сна) [9, 10].

Имеются сведения о немедицинском употреблении циклопентолата совместно с психотропными и наркотическими средствами, а также о злоупотреблении им людьми, находящимися на лечении от алкоголизма и героиновой зависимости [11].

Таким образом, циклопентолат может присутствовать в органах и биожидкостях людей, погибших от отравления веществами психотропного и наркотического действия.

В судебно-химическом отношении циклопентолат изучен недостаточно. В частности, остаются малоизученными вопросы распределения данного вещества в организмах теплокровных.

Цель исследования — изучение особенностей распределения 2-(диметиламино)этил-(1-гидроксициклопентил) (фенил)ацетата (циклопентолата) в организме теплокровных животных (крысы) при внутрижелудочном введении.

Объект исследования — 2-(диметиламино)этил-(1-гидроксициклопентил)(фенил)ацетат (циклопентолат) (РСО; содержание основного вещества не менее 99%. Определено методом неводного титрования) [1].

Моделью теплокровных организмов, на которой исследовали особенности распределения циклопентолата, являлись крысы.

Пятимесячным крысам-самцам линии Wistar (5 опытных групп по 5 особей в каждой) с массой 275—305 г однократно вводили в желудок через зонд циклопентолат в дозе 1300 мг на 1 кг массы тела в виде водной суспензии. Через определенное время (20, 150 или 360 мин) животным давали эфирный наркоз и декапитировали. После декапитации и гибели животных их подвергали вскрытию. Одинаковые биологические матрицы (ткани органов, содержимое желудка и тонкой кишки или кровь), взятые от животных каждой из групп, объединяли и исследовали на наличие в них отравляющего агента. Параллельно подвергали исследованию биоматрицы животных контрольной группы (5 особей), которым вводили в желудок дистиллированную воду, не содержащую анализируемого соединения [12, 13].

Изолирование из биоматериала. Определенное количество биологической ткани, измельченной ножницами до размеров 0,2—0,5 см, или крови настаивали при периодическом перемешивании дважды по 45 мин с порциями ацетона, масса каждой из которых в 2 раза превышала массу биоматериала. Отдельные извлечения объединяли в выпарительной чашке и испаряли растворитель до получения сухого остатка.

Схема очистки извлечений. Сухой остаток растворяли в 5 мл 6% раствора щавелевой кислоты, образующийся раствор вносили в делительную воронку, доводили реакцию среды 10% раствором гидроксида натрия до рН 9,0 и экстрагировали исследуемое соединение хлороформом (5 мл×2). Органические экстракты объединяли, пропускали через 2 слоя фильтровальной бумаги, фильтрат собирали в выпарительной чашке, растворитель выпаривали из фильтрата в токе воздуха при температуре 18—22 °С до сухого остатка и растворяли в 5 мл хлороформа. Порции хлороформного раствора по 0,5—2,0 мл каждая вносили в выпарительные чашки (№ 1 и № 2) и испаряли растворитель.

Идентификация в тонком слое силикагеля. Сухой остаток в чашке № 1 обрабатывали 0,4—0,6 мл ацетона, количественно перенося образующийся раствор на линию старта стандартной пластины Сорбфил ПТСХ-АФ-В-УФ в виде полосы. Также на линию старта наносили в виде круга диаметром 3—4 мм 5—10 мкл 0,2% ацетонового раствора стандарта циклопентолата. Подвижной фазой при хроматографировании являлась система растворителей гексан-диоксан-пропанол-2 (10:5:1). Хроматограммы проявляли в УФ-свете. Циклопентолат идентифицировали по величине абсолютной хроматографической подвижности (Rf=0,34).

Идентификация по особенностям поглощения в УФ-области спектра. После хроматографирования в тонком слое силикагеля по вышеописанной схеме часть хроматограммы, на которой находилось пятно исследуемого вещества, вырезали, помещали в пробирку, а вещество элюировали из сорбента 5 мл 95% этанола в течение 15 мин, периодически помешивая содержимое пробирки. Этанольный элюат отделяли и исследовали его фотоабсорбцию в области кварцевого ультрафиолета (190—360 нм) с помощью спектрофотометра СФ-2000 и кюветы с толщиной рабочего слоя 10 мм. Измерения проводили на фоне контрольного элюата. При значительном содержании исследуемого соединения в анализируемом элюате последний перед измерением оптической плотности разбавляли 95% этанолом.

Исследования извлечений из биоматриц, взятых у контрольных животных, проводили по описанной схеме.

Идентификация по реакции образования ацинитросоли. Этанольный элюат после исследования его с помощью УФ-спектрофотометрии вносили в выпарительную чашку и испаряли растворитель до получения сухого остатка. Остаток обрабатывали 5 мин при перемешивании 0,5 мл 10% раствора нитрата калия в 94% серной кислоте, после чего к реакционному раствору добавляли 1 мл воды и 5 мл 20% раствора гидроксида натрия.

Идентификация с применением метода хромато-масс-спектрометрии (ГХ-МС). Остаток в чашке № 2 растворяли в 2—4 мл хлороформа. При большом количестве анализируемого соединения полученный раствор разбавляли хлороформом. Затем 2 мкл хлороформного раствора отбирали для хроматографирования. Пробу вводили без деления потока. Хроматографический процесс осуществляли в капиллярной колонке HP-5MS (длина 30 м, внутренний диаметр 0,25 мм, толщина неподвижной фазы 0,25 мкм), используя газовый хроматограф Маэстро Г.Х. модели 7820 с квадрупольным масс-селективным детектором Agilent Technologi 5975. Температура инжектора составляла 260 °C, интерфейса детектора — 280 °C; начальная температура термостата колонки — 90 °C, затем температуру колонки изменяли от 90 до 280 °C со скоростью 20 °С/мин; температура квадрополя составляла 150 °C, источника ионов — 230 °C. Подвижной фазой являлся гелий, подаваемый со скоростью 23,10 мл/мин с задержкой на растворитель 3 мин. Масс-селективный детектор работал в режиме электронного удара (70 эВ). Сигнал регистрировали по полному ионному току. Диапазон сканирования 40—500 m/z. Вещество идентифицировали по характерному времени удерживания (7,78 мин) и совпадению масс-спектра со стандартным на 86% и более.

Оценка количественного содержания. Количество циклопентолата вычисляли, исходя из площади хроматографического пика (время удерживания 7,78 мин), полученного регистрацией сигнала, в области характеристического молекулярного иона 58 m/z, используя предварительно рассчитанное уравнение градуировочного графика.

Идентификацию анализируемого вещества проводили по хроматографической подвижности в тонком слое силикагеля. Хроматограммы проявляли в УФ-свете. Исследуемое соединение определялось на светлом общем фоне пластины как темное пятно, его Rf =0,34±0,03, что соответствовало Rf вещества-стандарта.

По особенностям поглощения в УФ-области спектра сравнили спектральные кривые этанольных растворов циклопентолата, выделенного из органов, и их содержимого и крови животных и очищенного, и этанольного раствора вещества-стандарта (рис. 1).

При идентификации по реакции образования ацинитросоли в присутствии циклопентолата наблюдали появление желтого окрашивания реакционного раствора.

В извлечениях из тканей органов, содержимого желудка и кишечника, а также крови крыс контрольной группы циклопентолат или похожие по структуре вещества отсутствовали. Максимальное фоновое поглощение элюатов из участков контрольных хроматограмм в пересчете на извлечение из 5 г биоматриц подопытных животных составило 0,018 ед. оптической плотности (ед. опт. пл.) при λ=259 нм.

При идентификации с помощью ГХ-МС время удерживания анализируемого вещества совпало со временем удерживания вещества-стандарта и составило 7,78±0,07 мин (рис. 2, 3).

В масс-спектрах обнаружили характерные для молекулы циклопентолата сигналы положительно заряженных частиц (ионы) с массой 42, 55, 58, 65, 71, 89, 118, 162, 207 и 262 m/z (см. рис. 2, 3). Интенсивность иона 58 m/z условно принимали за 100%.

Уравнение градуировочного графика для оценки количественного содержания циклопентолата методом ГХ-МС в данном случае имеет вид: S=943 925∙C±6610, где S — площадь хроматографического пика; C — массовое содержание определяемого вещества в хроматографируемой пробе в нанограммах.

Линейный участок графика соответствует интервалу концентраций 0,05—400 нг в хроматографируемой пробе. Коэффициент корреляции более 0,99. Относительная ошибка среднего результата при определении циклопентолата в субстанции с помощью ГХ-МС не превышала 1,52% (n=6; p=0,95).

Результаты определения циклопентолата в органах и крови отравленных животных, исследованных через различные промежутки времени после введения отравляющего агента в желудок, представлены в таблице.

Как свидетельствуют полученные данные, в течение всего исследуемого времени, циклопентолат в неизменном виде обнаруживали в органах и крови отравленных животных. Через 20 мин после поступления в организм наибольшие его количества определяли в содержимом желудка (3606,61±440,83 мг/100 г), тонкой кишке (856,08±122,81 мг/100 г), селезенке (752,094±81,463 мг/100 г) и мозге (483,45±39,45 мг/100 г). Через 150 мин после введения в наибольшем количестве исходный отравляющий агент присутствовал в содержимом желудка (2883,66±435,38 мг/100 г), ткани тонкой кишки (1343,87± 109,85 мг/100 г), мышцах (1150,93±216,29 мг/100 г), ткани желудка (930,08±122,84 мг/100 г), селезенке (142,78±22,89 мг/100 г) и легких (43,65±4,32 мг/100 г). Спустя 360 мин после введения циклопентолата он обнаруживался преимущественно в тканях желудка и тонкой кишки (2235,72±232,35 и 1044,36±120,92 мг/100 г), содержимом желудка и тонкой кишки (611,02±151,26 и 161,70±28,84 мг/100 г), соответственно, а также в селезенке (36,17±4,13 мг/100 г) и легких (34,18±4,74 мг/100 г).

1. Исследованы особенности распределения 2-(диметиламино)этил-(1-гидроксициклопентил)(фенил)ацетата в организме теплокровных животных (крысы) через 20, 150 и 360 мин после его однократного введения в желудок в дозе 1300 мг/кг.

2. Установлено, что через выбранные интервалы времени после введения наибольшие количества 2-(диметиламино)этил-(1-гидроксициклопентил)(фенил)ацетата в миллиграммах на 100 г биоматериала) обнаруживаются в содержимом и тканях желудка и тонкой кишки, мозге, мышцах, селезенке и легких.

3. В отношении разработанных методик определения исследуемого вещества проведены валидационные мероприятия по критериям линейности, селективности, правильности и прецизионности. Методики могут быть рекомендованы к применению в практике судебно-химического анализа.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

¹e-mail: R_WLADIMIR@yandex.ru;
ORCID: http://orcid.org/0000-0001-8872-0691