В судебно-медицинской практике для посмертной диагностики заболеваний и интоксикаций широко используются гистологические и современные гистохимические методы исследования головного мозга, дающие представление о прижизненной метаболической и синтетической функциях нейронов. Морфометрические показатели ядер нейронов позволяют оценить изменение активности внутриклеточного белкового биосинтеза, обусловленное деструктивными процессами. Ядрышковый организатор (NOR - nucleolar organizing region) в ядрах нейронов представлен нуклеолами, содержащими рибосомную ДНК (rDNA), которая, будучи аргирофильной (AgNOR), выявляется при окрашивании серебросодержащими красителями (silver-stainedNOR). По мнению M. Krzyzanowska и соавт. [1], по параметрам нуклеол, выявляемых в ядрах нейронов в проходящем свете, можно судить о биосинтезе белка при изучении биомеханики клеточного стресса, вызванного воздействием неблагоприятных факторов различной природы. Таким образом, AgNOR является высокочувствительным индикатором белкового биосинтеза в нейронах [1, 2].

В многочисленных работах показано, что механизмы психогенного воздействия в значительной мере функционально связаны с активностью серотонинергической системы, основные центры которой в головном мозге человека структурно ограничены нейронными ядрами дорсального шва (DRN) и полями мезолимбической префронтальной коры (PFC), играющими важную роль в регулировании поведения. Через пирамидальный тракт центры PFC могут воздействовать на DRN [3-5].

Хроническая алкогольная интоксикация (ХАИ) возникает как следствие множественных алкогольных эксцессов, приводящих к тяжелым полиорганным функциональным и морфологическим нарушениям. Несмотря на выраженность клинической картины и многообразие патоморфологических изменений, дифференциальная диагностика ХАИ в судебно-медицинской практике вызывает затруднения вследствие скудности анамнестических сведений и отсутствия признаков, строго патогномоничных для воздействия этилового спирта [6].

Предложена гипотеза, согласно которой при ХАИ избирательно поражаются серотонинергические нейроны DRN, выявляемые по методике окрашивания AgNOR [7].

Цель работы — изучение изменения AgNOR-параметров в нейронах DRN для использования их при дифференциальной диагностике смерти от хронической алкогольной интоксикации.

Исследовали показатели активности белкового биосинтеза: количество и площадь нуклеол в ядрах нейронов у умерших с признаками ХАИ (n=20) в сопоставлении с контрольной группой (n=13). Для выявления морфологических структур биосинтеза белков в нуклеолах серотонинергических нейронов ядер дорсального шва головного мозга применяли окрашивание гистологических препаратов по методу AgNOR. Провели сравнительный статистический анализ полученных результатов с вычислением коффициентов достоверности.

Исследовали параметры NOR (количество ядрышек и площадь области нуклеол) в ядрах крупных нейронов (магноциты) ствола головного мозга трупов, поступивших в судебно-медицинский морг после механической травмы (кроме травмы головы). Всего исследовали 33 трупа мужчин в возрасте от 36 до 50 лет, смерть которых наступила от острой кровопотери. При изучении медицинских документов в 20 случаях выявили хроническое злоупотребление спиртными напитками, подтвержденное наличием морфологических признаков ХАИ, указанных в судебно-медицинском диагнозе в качестве фонового состояния по результатам вскрытий. В 13 случаях признаков ХАИ не обнаружили (контрольная группа). Провели лабораторные биохимические, токсикологические и микроскопические исследования, исключающие иные, кроме ХАИ, интоксикации и тяжелые патоморфологические изменения.

Кусочки дорсальных отделов ствола головного мозга, вырезанные на уровне мостомедуллярной борозды, фиксировали в течение 1 нед в свежеприготовленном растворе 10% формальдегида в фосфатном буфере. С помощью роторного микротома вдоль ретрокаудальной оси DRN из парафиновых блоков приготовили гистологические срезы толщиной 10 мкм, направляя в работу каждый сотый срез (по 5 срезов от каждого трупа). Дегидратированные срезы окрашивали свежеприготовленным водным раствором нитрата серебра в течение 45 мин. Полученные препараты исследовали в проходящем свете микроскопа при увеличении 400. По методике AgNOR ядрышки и область нуклеол в ядрах нейронов DRN окрашивались интенсивно, имели четкие границы (см. рис. 1).

AgNOR-параметры определяли раздельно в каждом из подъядер DRN: вентральном, вентролатеральном, дорсальном, межфасцикулярном [8]. В одном гистологическом препарате исследовали в среднем 20 наиболее крупных нейронов (магноциты) с хорошо различимыми границами ядер и областей AgNOR. Таким образом, в каждом случае смерти AgNOR-параметры регистрировали не менее чем в 200 нейронах. Изучали площадь ядра (мкм²), количество ядрышек (AgNOR number), площадь, занимаемую нуклеолами в ядрышке (AgNOR area, мкм²), коэффициент отношения площади ядрышка к площади ядра [9]. AgNOR-параметры определяли с помощью оптического микроскопа, адаптированного с компьютерной системой анализа изображений (cellSens®, «Олимп», Япония).

Для статистического исследования использовали программу Statistica 10 (StatSoft®, Inc.2011, www.statsoft.com). Для статистического анализа AgNOR-параметров применяли непараметрическое сравнение в группах. Различия в AgNOR-параметрах оценивали посредством количественных измерений с вычислением коэффициентов достоверности.

Установили, что при ХАИ в нейронах всех подъядер DRN наблюдается выраженное изменение совокупных показателей AgNOR-параметров (см. таблицу).

При ХАИ наряду со снижением количественных показателей AgNOR наблюдали уменьшение площади ядер нейронов. Наиболее существенные отличия AgNOR при ХАИ по сравнению с контролем выявили в величине площади ядрышек (AgNOR area) и коэффициента отношения c/a. Точность полученных результатов превысила 80%, что составляет диагностическую ценность метода окрашивания AgNOR (p<0,05) [10].

Полученные данные позволили считать, что в патогенезе ХАИ имеется изменение интенсивности внутриклеточного биосинтеза белка в нейронах DRN.

Для уточнения характера изменений AgNOR-параметров при ХАИ провели сравнительное исследование площади ядрышек в ядрах нейронов (AgNOR area) в каждом из подъядер DRN: вентральном (V), вентролатеральном (VL), дорсальном (D), межфасцикулярном (IF) и сопоставили со значениями в контрольной группе (рис. 2).

Наиболее выраженное снижение AgNOR-параметров при ХАИ отметили в дорсальной группе подъядер DRN.

Проведенные исследования подтверждают данные о том, что определяемые по методике AgNOR нервные клетки являются серотонинергическими нейронами DRN [11-13]. При ХАИ в этих нейронах наблюдается уменьшение параметров AgNOR. Данный признак может выступать дифференциально-диагностическим критерием при решении вопроса о причине смерти от ХАИ. Методика окрашивания AgNOR можно использовать для характеристики транскрипционной активности и рибосомного синтеза РНК в нейронах.

Таким образом, при хронической алкогольной интоксикации уменьшаются AgNOR-параметры в нейронах DRN. Полученные результаты могут указывать на изменение транскрипционной активности рибосомной ДНК.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

*е-mail: mrzv66@mail.ru;
ORCID: http://orcid.org/0000-0002-0594-257X