В основе естественного разложения трупа лежат процессы деструкции органических веществ, возникающие под действием различных представителей некрофильных сообществ: микроорганизмов, насекомых, простейших и пр. Немаловажную роль в гниении белков играют ферментные системы некробиома или посмертного микробиома — сложной биологической системы, которая формируется поэтапно и является специфичной для каждой стадии путрификации (гнилостное разложение) [1].

Стадийность разложения с учетом комплекса микробиологических, биохимических и других факторов рассматривается многими авторами [2—7]. Так, группа ученых под руководством N. Lents [8] исследовала ассоциации бактерий, выделенных из слухового прохода и носовых каналов 21 трупа в разные периоды разложения. Для идентификации микроорганизмов авторы использовали метод метагеномного секвенирования ДНК. В результате анализа полученных данных была построена статистическая модель, позволяющая определить посмертный интервал неизвестных образцов трупного материала с точностью до 2 дней.

В других исследованиях [9, 10] указано, что последовательную смену этапов гниения можно объяснить многообразием химических компонентов, формирующихся после посмертного окоченения. Белки, жиры, углеводные и минеральные вещества подвергаются активной биотрансформации именно со стороны микроорганизмов и преобразуются в более чем 1300 различных соединений, химический состав которых зависит от срока разложения, вида микроорганизмов, температуры, влажности, концентрации кислорода, состава органов и тканей, подвергающихся разложению, и ряда других факторов внешней и внутренней среды.

При температуре около 0 °C развивается аммонификация, вызванная жизнедеятельностью психрофильных бактерий, относящихся к родам Pseudomonas, Alcaligenes, Acinetobacter, Moraxella и Aeromonas. Доминирующим является род Pseudomonas, который относится к гамма-подклассу Proteobacteria и включает P. fluorescence, P. fragi, типовые виды P. aeruginosa и др. Некоторые из видов рода представляют α-подкласс Proteobacteria (Brevundimonas, Devosia, Spingomonas), тогда как Acidovorax, Comamonas и Telluria относятся к β-подклассу.

При повышении температуры до 20—27 °С гниение белков контролируется мезофильными некробионтами: Proteus vulgaris, Serratia marcescens, Васillus subtilis, Васillus mesentericus, Васillus mycoides, Clostridium sporogenes, Clostridium putrificum, Clostridium perfringens и другими представителями некрофильной микрофлоры.

Независимо от вида микроорганизмов, факторов окружающей среды и стадии путрификации процесс микробного разложения органических субстратов сводится к некоторым общим принципам [10]:

— активность распада органических соединений зависит от синтеза микроорганизмами внеклеточных экзоферментов, которые в большинстве случаев относятся к группе гидролаз;

— процесс разложения находится под контролем различных видов микроорганизмов, синтезирующих необходимые экзоферменты;

— начальная деструкция субстрата под действием экзоферментов — это стадия, лимитирующая скорость использования субстрата и соответственно рост микроорганизмов.

К наиболее изученным экзоферментам микроорганизмов относятся протеазы, которые контролируют процессы аммонификации и часто синтезируются в виде проферментов и активируются только в результате посттрансляционной модификации в процессе транспорта или аутокаталитической активации [11—13]. Под действием протеолитических ферментов микроорганизмов образуются комплексы высокомолекулярных промежуточных продуктов распада белков, состоящие из пептонов, альбумозы и полипептидов, расщепляющихся на разных этапах протеолиза до отдельных аминокислот.

Вирулентные штаммы микроорганизмов с выраженной протеолитической активностью способны расщеплять белок и пептон до конечных продуктов аммонификации — C₈H₇N, H₂S, (NH₂)₂CO и NH₃ [14]. Протеазы подразделяются на эндо- и экзопептидазы в зависимости от положения расщепляемой пептидной связи в молекуле белка. Эндопептидазы действуют на пептидные связи внутри полипептида, а экзопептидазы отщепляют аминокислотные остатки от С- или N-конца полипептидной цепи. В зависимости от природы активного центра среди протеаз выделяют сериновые, цистеиновые, аспарагиновые и металлсодержащие, которые в свою очередь относятся по специфичности к аминокислотным остаткам в участке расщепления [15]. Перечисленные ферменты различаются по чувствительности к ингибиторам. Сериновые протеазы активного мезофильного некробионта Bacillus subtilis чувствительны к диизопропилфторфосфату и его фосфорорганическим производным, которые способны к ковалентной связи с гидроксильной группой серинового остатка в активном центре молекулы белка. Цистеиновые протеазы многих некробионтов чувствительны к ионам металлов, алкилирующим агентам и окислителям. Под их влиянием также находится β-карбоксильная группа аспарагиновой кислоты пепсиноподобных ферментов многих видов дрожжей и микроскопических грибов, входящих в состав ассоциации некробионтов. Микроорганизмы способны синтезировать широкий спектр протеолитических ферментов, активность которых варьирует в широком диапазоне температур (от 4 до 110 °С) и значений рН (от 0,1 М НCl до 0,1 М NaOH) [15], а гидролитические ферменты класса протеаз являются модельными соединениями для изучения взаимосвязей между структурой белка и функцией фермента. В связи с этим востребованность их как объектов исследования для целей микробной биотехнологии, молекулярной биологии и генной инженерии остается весьма значительной [16—20].

Цель исследования — установить особенности гнилостного разложения трупа под действием ферментных систем некробиома применительно к диагностике давности постмортального периода.

Исследование выполняли в соответствии с международными этическими нормами, изложенными в Хельсинкской декларации Всемирной медицинской ассоциации «Рекомендации для врачей по проведению биомедицинских исследований на людях» и Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях» (Страсбург, 1986) [21], а также требованиями приказа Минздрава СССР № 755 «О мерах по дальнейшему совершенствованию организационных форм работы с использованием экспериментальных животных» от 12.08.77 [22] и другими нормативными документами (заключение Комитета по медицинской этике при Министерстве здравоохранения и социального развития РК и Петрозаводском государственном университете № 35 от 06.11.15).

В качестве модели использовали 4 трупа свиньи домашней (Sus scrofa domesticus L.) массой 50—70 кг. Через 2 ч после умерщвления традиционным способом на скотобойне трупы животных поместили в исследуемые биотопы. Исследования проводили в южной части Республики Карелия (р-н Лососинное) в период 2015—2016 гг. По две трупные приманки заложили в лесных (ельник черничный) и открытых (лесной луг) биотопах с использованием разработанного метода изучения некрофильного сообщества на трупах крупных животных [23].

Для анализа некробионтов пробы отбирали в асептических условиях с различных участков тела (кожа, копыта, шерсть) и ложа трупа и заключали в 30% раствор глицерина. Произвольно выбрали пробы, полученные от трупов с давностью смерти на 30-е и 136-е сутки. Исследовали протеолитические свойства Pseudomonas spp., Bacillus mycoides, Bacillus subtilis, Clostridium putrificum и Clostridium sporogenes (методы идентификации чистых культур в составе ассоциации некробиома описаны ранее [24]). Культивирование микроорганизмов проводили в колбах Эрленмейера объемом 250 мл на шейкере с частотой колебания платформы 200 об/мин при температуре 27 °C. Посевным материалом служила 18-часовая ночная культура, контролировали рост культуры по изменению оптической плотности (OП) микроорганизмов. Рост биомассы оценивали нефелометрически на фотоэлектроколориметре ФЭК-56ПМ со светофильтром 9 при длине волны 590 нм. За единицу биомассы принимали поглощение в сантиметровой кювете.

Казеинолитическую активность (КА) или общую протеолитическую активность (ОПА) чистых культур микроорганизмов определяли методом Ансона в модификации И.С. Петровой [20]. При интерпретации полученных данных учитывали основные показатели окружающей среды на момент отбора проб (табл. 1).

Изменчивость состава микробиома трупа и его ложа на двух исследуемых сроках изучали методом главных компонент. Задачи анализа – выявить структуру отношений многомерных данных, вычленяя группы (плеяды) зависимых признаков и группы (кластеры) сходных объектов обозначить общие причины по которым признаки изменяются согласованно, а объекты оказываются сходными. Исходные значения нормировали, компоненты с дисперсией менее единицы относили к несущественным и не рассматривали. Факторные нагрузки представляли произведением собственных векторов и стандартных отклонений соответствующих главных компонент. Такой метод позволил сравнивать коэффициенты одного признака в разных главных компонентах [25]. Признаки группировали в плеяды исходя из наибольших величин их факторных нагрузок в рядах главных компонент.

Проведен качественный и количественный анализ доминантных видов некробионтов, способных к синтезу протеолитических ферментов, контролирующих путрификацию трупа на воздухе на 30-е и 136-е сутки посмертного периода:

1. Представители Pseudomonas spp. (25 штаммов) — прямые или изогнутые палочки, подвижные, грамотрицательные; хемоорганотрофные с дыхательным типом метаболизма; способные к росту в широком диапазоне температур от 4 и ниже до 43 °C.

2. Bacillus mycoides (20 штаммов) — стрептобациллы с центральным расположением спор, грамположительные; хемоорганотрофные; аэробы или факультативные анаэробы; способны к росту при температуре от 10 до 45 °C.

3. Bacillus subtilis (20 штаммов) — стрептобациллы с центральным расположением спор, грамположительные; хемоорганотрофные; аэробы или факультативные анаэробы; способны к росту при температуре от 10 до 45 °C.

4. Clostridium putrificum (20 штаммов) — полиморфные палочки с терминальным расположением спор, грамположительные; хемоорганотрофные; облигатные анаэробы.

5. Clostridium sporogenes (20 штаммов) — полиморфные палочки с центральным расположением спор, грамположительные; хемоорганотрофные; облигатные анаэробы.

В анаэробных условиях гниение белка сопровождается образованием NH₃, который вступает в реакцию с неорганическими кислотами и образует соли: NH₄NO₃, (NH)₂SO₄, (NH₄)₂CO₃. Общая протеолитическая активность доминантных видов некробионтов на 30-е и 136-е сутки путрификации трупа отражена на рисунке.

Гидролиз казеина на низком фоновом уровне, в среднем 0,12±0,01 мм/мл, отметили у всех исследованных штаммов. Максимальной оказалась эффективность гидролиза белка для мезофильных некробионтов рода Clostridium (6,83 и 5,25 мм/мл), выделенных на 30-е сутки. Соотношение клостридиальных продуцентов протеаз в составе некробиома ложа трупа, шерсти, копыт и костей изменилось с 13,12% (количество Cl. рutrificum в составе некробиома шерсти на 30-е сутки) до 39,3% (количество Cl. рutrificum в составе некробиома ложа трупа на 136-е сутки) (табл. 2). Наименьшую протеолитическую активность в отношении казеина установили у психрофилов группы псевдомонад — 0,41 и 1,22 мм/мл, на 30-е и 136-е сутки соответственно. Несмотря на увеличение численности Pseudomonas spp. на 136-е сутки (см. табл. 2) и повышение их ферментативной активности почти в 3 раза (см. рисунок), во всех исследованных образцах основной контроль процессов аммонификации белков принадлежал спорогенным культурам рода Bacillus — B. mycoides, B. subtilis и Clostridium — Cl. putrificum, Cl. sporogenes.

Таким образом, интенсивность гнилостного разложения трупа зависит как от срока посмертного периода и температуры окружающей среды, так и от количества эффективных протеолитиков, к которым можно отнести мезофильные микроорганизмы рода Bacillus и Clostridium.

На 30-е сутки при температуре почвы и воздуха 11,6 и 14,7 °С в исследованных образцах доминировали представители рода Bacillus. Среди бацилл процент активных продуцентов протеаз изменялся от 22,2 (фрагменты костей) до 63,5% (фрагменты копыт). К 136-м суткам температура окружающей среды снизилась до 3,0—4,5 °С и в образцах стали доминировать психрофильные псевдомонады, среди которых относительное количество штаммов, продуцирующих протеиназы, изменялось от 38,1 (фрагменты шерсти) до 61,2% (фрагменты копыт).

При благоприятных условиях окружающей среды для мезофиллов на 30-е сутки, а для психрофилов на 136-е сутки отметили увеличение активности гидролиза субстрата во внешней среде, что вызвало транспорт низкомолекулярных продуктов ферментации в клетки и повышение синтеза экзоферментов для Bac. mycoides в 2,3 разa, Bac. cereus в 1,8 раза, Cl. putrificum в 1,7 раза, Cl. sporogenes в 2,8 раза и для Pseudomonas sp. в 2,9 раза (p<0,01).

При анализе полученных результатов необходимо учитывать, что на активность синтеза экзоферментов у исследованных культур некробионтов может влиять как общая регуляция метаболизма микроорганизмов, так и частные процессы в клетке: спорообразование, подвижность клеток или их компетентность к ДНК-трансформации. У типичных представителей посмертного микробиома, бактерий рода Bacillus, синтез протеаз и амилаз может подавляться в фазе экспоненциального роста, но в стационарной фазе происходит его дерепрессия [26]. В конце экспоненциальной фазы роста, когда истощается запас легкометаболируемых низкомолекулярных субстратов, у бацилл возникает потребность в экзоферментах, обеспечивающих поступление питательных веществ в результате активного разложения белков.

Применение многомерного анализа позволило выявить две значимые главные компоненты (ГК) — срок разложения (ГК 1) и протеолитическую активность выделенных видов микроорганизмов (ГК 2). Срок разложения меняет некробиом трупа, и важными индикаторами на исследуемых субстратах являются виды Bac. mycoides и Bac. Subtilis, Pseudomonas spp., Cl. putrificum и Cl. sporogenes, однако между ними существует временное разграничение. На 30-е сутки посмертного периода были активны только представители рода Bacillus, а в поздний период — оставшиеся виды микроорганизмов. Эта зависимость прослеживалась на всех субстратах исследования (копыта, кости, шерсть, ложе).

Вторая главная компонента разделяет микроорганизмы, обнаруженные на копытах трупа и в его ложе на 136-е сутки. В данном случае установлена существенная разница в протеолитической активности видов, выделенных в пробах с различных участков копыт, костей, шерсти и ложа трупа на одном сроке посмертного периода. Наибольшую нагрузку здесь несут виды, составляющие комплекс микроорганизмов на копытах на 136-е сутки постмортального периода: превалирует Pseudomonas spp., составляя более 60% (см. табл. 2). Виды, обнаруженные в ложе трупа в тот же срок, имели наименьшую протеолитическую активность.

1. Выявлена специфика путрификации трупа под действием протеолитических ферментов псевдомонад, бацилл и клостридий, которая выражалась в изменении количества штаммов некробионтов, продуцирующих протеазы в составе целого трупа и его фрагментов при гниении на воздухе к 30-м и 136-м суткам посмертного периода.

2. Оценена протеолитическая активность некробионтов в различные сроки путрификации с изменением температуры окружающей среды. Для мезофильных некробионтов — представителей родов Bacillus и Clostridium увеличение срока путрификации на 106 сут и снижение температуры среды на 10 °C вызвало снижение протеолитической активности, а для Pseudomonas — увеличение эффективности гидролиза белка.

3. Показаны особенности видового состава микроорганизмов в зависимости от срока разложения трупа с изменением температурного фактора: смена видов микроорганизмов, способных к аммонификации белков трупа, проявилась в разнонаправленном доминировании мезофильных представителей родов Bacillus и Clostridium и психрофильных Pseudomonas. Максимальная активность для Bacillus и Clostridium зафиксирована при температуре окружающей среды 11,6—14,7 °С, а для Pseudomonas при 3—4,5 °С.

4. С помощью полученных данных возможны создание дополнительной методики установления сроков посмертного периода, базирующейся на изменениях активности микроорганизмов, и более объективная диагностика повреждений трупа и его фрагментов в процессе путрификации.

5. Дальнейшие исследования должны быть направлены на выявление степени влияния отдельных факторов окружающей среды на посмертную активность микробной флоры.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Статья подготовлена при финансовой поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации в рамках государственного задания № 656−17.