Определение содержания этанола в биожидкостях (кровь и моча) — востребованный вид анализа в медицинской и судебно-медицинской практике, который регламентирован правовыми документами [1—3]. Точным и информативным методом определения содержания этанола в биожидкостях является метод газовой хроматографии, на основе которого разработан ряд методик. В нашей стране наиболее широкое распространение получил «алкилнитритный» метод [4], который состоит в предварительном получении алкилнитритов спиртов с последующим газохроматографическим анализом паровой фазы. В мировой практике этот подход полностью вытеснен более простым методом — прямым хроматографическим анализом паровой фазы анализируемого образца без предварительной дериватизации аналитов. Современные дозаторы паровой фазы позволяют автоматизировать процесс анализа. В ряде случаев для повышения достоверности идентификации аналитов хроматографический анализ проводят параллельно на двух колонках с различной полярностью. Например, фирма «Agilent Technologies» предлагает специальный анализатор на основе газового хроматографа Agilent 7890 В и дозатора паровой фазы Agilent 7697А, реализующий двухколоночную схему [5, 6].

В отечественной практике известна методика определения летучих органических соединений, в том числе этанола, методом статического парофазного анализа с использованием автоматического дозатора для ввода жидких проб [7, 8]. На сегодняшний день данная методика не аттестована. В 2014 г. была разработана и аттестована методика определения массовой концентрации этанола в пробах крови методом статического парофазного анализа без перевода этанола в этилнитрит [9]. Несомненным преимуществом данной методики является возможность автоматизации ввода пробы, но методика метрологически аттестована только для определения этанола, что ограничивает область ее применения.

Цель исследования — обобщение как отечественных, так и зарубежных подходов по разработке и аттестации методики определения низкомолекулярных спиртов в образцах биоматериалов (кровь и моча) с автоматическим дозированием пробы. В ходе разработки методики учитывали специфику современной практики судебно-медицинского анализа, а также соблюдали требования действующих нормативных и правовых документов.

При разработке методики и получении статистических данных использовали две хроматографические системы:

— газовый хроматограф Хроматэк-Кристалл 5000, оснащенный испарителем, двумя пламенно-ионизационными детекторами (ПИД) и автоматическим парофазным дозатором ДАЖ-2М;

— газовый хроматограф Agilent Technologies 7890 В, оснащенный испарителем, двумя ПИД и парофазным пробоотборником Agilent Technologies 7697.

Для хроматографического анализа использовали две капиллярные колонки с различной полярностью неподвижной фазы: DB-ALC1 (длина 30 м, внутренний диаметр 0,32 мм, толщина фазы 1,8 мкм) и DB-ALC2 (длина 30 м, внутренний диаметр 0,32 мм, толщина фазы 1,2 мкм). Хроматографические колонки подсоединяли с помощью специального делителя к одному порту ввода пробы газового хроматографа.

Градуировочные растворы аналитов готовили с помощью стандартных образцов состава чистых веществ (метанол, этанол, пропанол-2, бутанол-1, бутанол-2, изобутанол, ацетон) производства ООО «ЭКОХИМ» с содержанием основного вещества не менее 99,5%.

Образцы крови и мочи брали у доноров-добровольцев. До проведения исследования образцы крови хранили при температуре –18 °С. Модельным образцом «густой крови» служила свернувшаяся кровь.

Согласно нормативным документам [1—3], для химико-токсикологических исследований в ходе проведения судебно-медицинской экспертизы используют образцы крови и/или мочи. Отбор проб слюны данными документами не предусмотрен. В судебно-медицинской практике экспертам часто приходится анализировать кровь с меньшим содержанием воды («густая кровь»), что сопряжено с рядом трудностей. Существующие методические документы не описывают процедуру анализа таких проб. В качестве объектов анализа для данной методики были выбраны моча и кровь, включая «густую кровь».

В практике судебно-медицинской экспертизы, помимо этанола, требуется определение содержания других низкомолекулярных спиртов и токсикологических соединений [10]. Разработанная методика позволяет количественно измерить содержание метанола, этанола, изопропанола, бутанола-2, изобутанола, бутанола-1 и ацетона (аналиты) в диапазоне от 0,05 до 10 г/дм³.

Метод измерений основан на хроматографическом анализе равновесной паровой фазы. Термостатирование проб, отбор паровой фазы и ввод ее в хроматограф проводили с использованием автоматического парофазного пробоотборника (рис. 1). Продолжительность цикла единичного хроматографического анализа при указанных условиях составила 8±0,1 мин. Была достигнута линейность откликов детекторов во всем диапазоне измерений для полного перечня аналитов. Предел детектирования оказался значительно меньше нижней границы диапазона измерений (табл. 1).

Методика допускает изменять перечень определяемых аналитов, а также использовать одноколоночный вариант, например при определении только этанола в образцах биоматериалов. Цикл хроматографического анализа при этом может быть сокращен до 4—5 мин.

Для расчета концентраций аналитов применяют метод внутреннего стандарта, в качестве которого используют пропанол-1. Градуировочные характеристики для аналитов определяют на основании анализа 5 градуировочных смесей, которые готовят путем смешивания 1 см³ градуировочного раствора и 4 см³ раствора внутреннего стандарта. Номинальные концентрации аналитов в градуировочных растворах 0,1, 0,2, 0,5, 2 и 5 г/дм³. Номинальная концентрация пропанола-1 в растворе внутреннего стандарта составляет 0,025 г/дм³.

При проведении анализа жидких образцов пробу биоматериала в количестве от 0,5 до 1 см³ смешивали с 4 см³ раствора внутреннего стандарта. Такой объем является достаточным, чтобы обеспечить требуемую точность измерений. Разбавление пробы раствором внутреннего стандарта позволяет, с одной стороны, снизить влияние матрицы, с другой — ускорить достижение межфазного равновесия.

Основная причина ошибочных результатов при количественном анализе биоматериалов — наличие в исходных образцах пропанола-1, который является внутренним стандартом. В связи с этим процедура методики предусматривает предварительное проведение для каждого образца анализа фоновой пробы, т. е. пробы биоматериала без добавления внутреннего стандарта. Это позволяет определить наличие пропанола-1 в исходном образце и оценить содержание определяемых аналитов. При наличии в анализируемом образце пропанола-1 по данной методике можно учесть его содержание при количественных расчетах. Если содержание аналитов меньше нижней границы измерений, методика позволяет не проводить повторный анализ с добавлением раствора внутреннего стандарта.

Особым случаем является анализ образцов «густой крови». Прямой парофазный анализ таких образцов обеспечивает полуколичественное определение содержания аналитов. Для получения результатов с гарантированной точностью разработали процедуру, включающую предварительную отгонку аналитов.

Отгонку образцов биоматериалов проводили в специальном аппарате (рис. 2). Навеску пробы 3±1 г помещали в отгонную колбу, добавляли 4 см³ раствора внутреннего стандарта 50±5 см³ насыщенного раствора натрия хлорида и полидиметилсилоксановую жидкость (ПМС-100 или ПМС-200) для предотвращения пенообразования. Отгонку проводили до тех пор, пока количество продукта отгонки не достигнет 5 см³, который затем переносили во флакон, предназначенный для установки в автоматический дозатор. В отгон переходит не менее 95% количества аналитов, содержащихся в исходной пробе, при этом соотношение компонентов, за исключением ацетона, в исходной пробе и отгоне практически не меняется. Степень потери ацетона в процессе перегонки оценивали при наработке статистических данных и учитывали при расчете погрешности анализа.

Процедура методики предусматривает 3 вида контроля: повторяемости, градуировочного коэффициента и правильности измерений. Контроль правильности проводили ежедневно, используя аналитические пробы, приготовленные из одного биоматериала. Контроль градуировочных коэффициентов осуществляли также ежедневно на примере одного из градуировочных растворов. Контроль правильности измерений проводили периодически: например, при внедрении методики в практику работы лаборатории.

Экспериментальные данные для оценки метрологических характеристик данной методики собирали согласно плану, составленному ВНИИМ им. Д.И. Менделеева. Измерения проводили для трех модельных матриц — вода, кровь и моча. Образцы готовили путем внесения в матрицу добавки аналитов, при этом полученные концентрации охватывали весь диапазон методики — от 0,05 до 10 г/дм³. Для каждого вида матрицы приготовили не менее 6 образцов, каждый образец измеряли с использованием двух хроматографических систем и варьированием операторов. Установленные метрологические характеристики представлены в табл. 2.

Разработана методика определения содержания низкомолекулярных спиртов (метанол, этанол, изопропанол, бутанол-1, изобутанол и бутанол-2) и ацетона в пробах биоматериалов (кровь, моча, «густая кровь»). Диапазон измеряемых концентраций (массовые доли) аналитов от 0,05 до 10,0 г/дм³ (от 0,005 до 1%). Впервые описана процедура количественного анализа проб с остаточным содержанием пропанола-1 и проб «густой крови». Выполнен эксперимент по наработке статистических данных, по результатам которого проведена метрологическая аттестация.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.