Молекулярно-генетический анализ хромосомной ДНК в обожженных костях: миф или реальность?

Авторы:
  • Е. Ю. Земскова
    ФГБУ «Российский центр судебно-медицинской экспертизы» Минздрава России, Москва, Россия, 125284
  • М. М. Бордюков
    ФГБУ «Российский центр судебно-медицинской экспертизы» Минздрава России, Москва, Россия, 125284
  • Н. В. Нарина
    ФГБУ «Российский центр судебно-медицинской экспертизы» Минздрава России, Москва, Россия, 125284
  • А. В. Ковалев
    ФГБУ «Российский центр судебно-медицинской экспертизы» Минздрава России, Москва, Россия, 125284
  • П. Л. Иванов
    ФГБУ «Российский центр судебно-медицинской экспертизы» Минздрава России, Москва, Россия, 125284
Журнал: Судебно-медицинская экспертиза. 2016;59(6): 4-9
Просмотрено: 574 Скачано: 177

В феврале 1994 г. в редакционной статье журнала «Nature Genetics» научный директор компании «Cellmark Diagnostics» Пол Дебенхам (Paul Debenham), комментируя историческую первую публикацию результатов молекулярно-генетической идентификационной экспертизы останков российской императорской семьи [1], написал примерно следующее:

‒ Эту работу (идентификацию костных останков) следует считать редкой демонстрацией возможностей молекулярно-генетического анализа, и она, конечно же, еще далека от реального практического применения. Поэтому кости большинства из нас смогут мирно покоиться в своих могилах. И все же… Если кто-то хочет быть уверен, что его останки ничего никому не расскажут, — тогда мы настоятельно рекомендуем кремацию…

Прошедшие 20 лет активного развития судебных молекулярно-генетических технологий внесли коррективы в слова британского профессора. Так, сегодня уже никто не будет спорить с тем, что молекулярно-генетическое типирование костных останков — это хотя и сложный, но вполне рутинный метод, который достаточно широко и успешно применяется в судебно-экспертной практике [2—5]. Однако кремация — в смысле высокотемпературного воздействия как радикальный способ сделать генотипирование биологических объектов абсолютно невыполнимым, казалось бы, как и тогда, сомнений не вызывает.

В области медицинской криминалистики есть работы, описывающие процессы, происходящие в костной ткани при воздействии высокой температуры и пламени [6, 7]. Из этих исследований косвенным образом вытекает, что в костях, подвергшихся такого рода воздействию при его достаточной интенсивности, когда последствия наглядно проявляются в виде обугливания, серого и белого каления, ДНК сохраниться не может. Есть учебники, прямо указывающие на то, что воздействие высокой температуры является эффективным способом удаления всех органических веществ из костной структуры (процесс, называемый озолением костного материала и используемый для изучения неорганического состава кости): «… для кости и хряща оптимальный режим озоления — температура 400—500 °С в течение 1,5 ч» (цит. по [8]).

Все это делает объективно невозможным молекулярно-генетическое исследование (генотипирование) подобных объектов.

Поскольку данный вопрос очень важен для правоохранительных органов — в плане понимания и правильного использования возможностей и ограничений судебно-экспертной молекулярно-генетической идентификации применительно к обожженным костным останкам, — в последние годы был выполнен целый ряд исследований, прямо направленных на изучение аналитической пригодности обгоревших костей для судебно-экспертного идентификационного молекулярно-генетического анализа [9—13].

На основании их результатов можно сделать следующие обобщения.

Приемлемый STR-профиль ядерной ДНК в принципе возможно установить в зубах, подвергшихся достаточно короткому — в течение нескольких минут — нагреванию при 300 °C [14]. Однако для костей, подвергшихся более длительному температурному воздействию даже при существенно меньших температурах, уже невозможно получить положительный результат. Так, при прокаливании кости в течение 2 ч, температурный предел сохранения матричной активности ДНК (т.е. способность ДНК обеспечивать получение амплификационного продукта в полимеразной цепной реакции (ПЦР) составляет всего лишь 210—180 °С для ампликонов в интервале длин от 100 до 500 п.н. соответственно [15].

Таким образом, именно на эти температурно-временные параметры следует ориентироваться при прогнозировании аналитической пригодности обгоревших костных объектов для генотипирования с использованием стандартных хромосомных STR-локусных мультиплексных панелей семейства IdentiFiler или PowerPlex [16, 17].

Следует обратить внимание еще на один момент. Обугливание кости начинается при температуре порядка 300—400 °С [6]. С учетом сказанного выше это означает, что нет никаких оснований ожидать положительных результатов генотипирования при исследовании обугленной костной ткани. В случае серого и белого каления (свидетельствующего об экспонировании костного объекта при температуре 400—680 °С и выше) не следует ожидать позитивного результата даже и с теоретической точки зрения, поскольку, как уже было сказано, в этом температурном интервале органические компоненты кости достаточно быстро и практически полностью выгорают [8].

Казалось бы, все логично.

Тем не менее совсем не редки случаи, когда при назначении экспертизы вещественных доказательств следствие настаивает на необходимости молекулярно-генетического исследования (генотипирования) сильно обгоревших костей. Недавно появилась работа, где авторы утверждают, что им удалось установить полный профиль STR-панелей IdentiFiler и PowerPlex 21-IDX в обожженных костных фрагментах в состоянии черного и серого каления (!?) [18].

Оставляем это утверждение на совести авторов, так как в этой работе не представлено никаких контрольных данных, которые могли бы свидетельствовать об истинности результата. Но надо понимать, что любая неопределенность в вопросе о возможности или невозможности добыть достоверные молекулярно-генетические данные из обожженных костных останков способна спровоцировать заблуждения, которые будут иметь крайне негативные последствия для расследования многих категорий уголовных дел.

В связи с этим нами проведено свое демонстрационноеисследование.

Не задаваясь целью выполнить еще одно масштабное изыскание, повторяющее ранее опубликованные работы, научная ценность которых не вызывает сомнений, мы поставили задачу осуществить наглядный эксперимент, проиллюстрировать его и таким образом внести ясность в данный вопрос.

Цель работы — попытка разрешения вопросао возможности или невозможности получения достоверной генетической информации из обожженных костных объектов, прежде всего в прикладном аспекте. Эксперимент планировался так, чтобы его посыл не был бы исключительно научным (например, сравнение результатов анализа ДНК при разных значениях температуры и времени прокаливания). Таких работ много, некоторые мы уже упомянули. Мы отталкивались от позиции более практической, а именно: имеются фрагменты кости, с узнаваемыми внешними признаками озоления разной степени (иными словами, есть кость в состоянии обугливания, кость в состоянии серого каления и т. д., — как это бывает в реальности в экспертной практике, когда эксперт-генетик не знает, при какой температуре и сколько времени обгорали костные останки). Попробуем сравнить результаты анализа ДНК при разном состоянии кости. Далее, уже в чисто научном аспекте, можно сопоставить эти результаты с теми температурными и временными параметрами озоления, которые использовали для моделирования того или иного заданного визуального эффекта.

Материал и методы

Объектом исследования послужила бедренная кость в хорошем состоянии, конкретно — фрагмент проксимального отдела правой бедренной кости от эксгумированных останков мужчины (рис. 1). Давность захоронения — 8 лет. Наиболее вероятный биологический возраст, диагностированный по состоянию возрастных изменений при визуальном и рентгенологическом исследовании, — 30—39 лет.

Рис. 1. Фрагмент проксимального отдела правой бедренной кости от эксгумированных останков мужчины. Возраст захоронения 8 лет. Наиболее вероятный биологический возраст 30—39 лет. а — общий вид, задняя поверхность; б — рентгенограмма (1 — высота стояния костномозговой полости, 2 — вершина малого вертела, 3 — эпифизарная линия, 4 — строение губчатого вещества головки бедренной кости, 5 — компактный слой диафиза.

Предварительно костный фрагмент был очищен от поверхностных наложений, затем из отделенного фрагмента диафизной части были сделаны выпилы примерно равной массы около 1,0 г. (рис. 2). Несколько фрагментов были оставлены интактными, остальные были подвергнуты прокаливанию при разных температурах и времени в электропечи СНОЛ 6/11-В, 000 («Технотерм», Россия) для достижения желаемого внешнего вида (конкретные параметры термообработки приведены в разделе «Результаты и обсуждение»).

Рис. 2. Отделенный участок диафизной части фрагмента бедренной кости (а), из которого сделаны выпилы (б) для последующей термической обработки.

Затем костные фрагменты измельчали с использованием виброизмельчителя Tissue Lyser II («Qiagen», Германия) в режиме 30 Гц/20 с; полученный костный порошок лизировали в течение 2 ч при 56 °C в присутствии реактивов PrepFiler BTA Lysis Buffer («Applied Biosystems», США), дитиотрейтола и протеиназы К («Qiagen», Германия).

Далее выделяли суммарную ДНК по сорбентной технологии на роботизированной станции Automate Express DNA Extraction System с применением штатного набора реактивов PrepFiler Express Forensic DNA Extraction Kit («Applied Biosystems», США). Полученные препараты использовали в качестве матричных препаратов ДНК для постановки ПЦР.

Матричную активность в препаратах ДНК определяли с использованием системы количественной энзиматической амплификации ДНК PowerQuant System («Promega», США).

Типирование полиморфных STR-локусов хромосомной ДНК проводили с использованием 24-локусной амплификационной панели AmpFlSTR GlobalFiler PCR Amplification Kit («Applied Biosystems», США).

Продукты ПЦР фракционировали электрофоретически с помощью системы капиллярного электрофореза ABI PRISM 3500 («Applied Biosystems», США).

Результаты и обсуждение

На первом этапе исследования необходимо было подобрать режимы прокаливания фрагментов исходной кости в муфельной печи. Подбор температурно-временных параметров был осуществлен, исходя из общих представлений о возможном минимальном времени обгорания при реальном происшествии (не менее 1 ч) и из заданного визуального эффекта (ставилась задача смоделировать внешний вид реально обгоревших костей в разной степени озоления). Эти параметры приведены в табл. 1.

Таблица 1. Параметры термической обработки костных образцов № 2—11

На рис. 3 (см.) показаны фрагменты, прошедшие термообработку, — репрезентативный экспериментальный ряд, начиная с интактной кости (объект № 1) и кости, визуально практически неотличимой от интактной (объект № 2: 100 °С/2 ч), ряд завершается костью в состоянии выраженного черного каления (объект № 7: 400 °С/1,5 ч). (Остальные фрагменты в состоянии серого и белого каления не представлены.)

Рис. 3. Внешний вид фрагментов костной ткани, прошедших термообработку, — репрезентативный экспериментальный ряд: № 1 (интактная кость), № 2 (100°С/2 часа), № 3 (100°С/2 часа + 200°С/1 час), № 4 (250°С/1 час), № 5 (250°С/1 час + 300°С/1 час), № 7 (400°С/1,5 часа).

Из всех экспериментальных фрагментов были получены препараты суммарной клеточной ДНК, и в каждом определена эффективная концентрации хромосомной ДНК (по сути — содержание ПЦР-активных ДНК-матриц) (табл. 2).

Таблица 2. Эффективная концентрация ДНК в препаратах, полученных из объектов № 1—7

Хорошо видно, что матричная активность ДНК сохраняется практически неизменной при 100 °C в течение 2 ч, затем, с возрастанием жесткости процедуры, резко падает, и уже в кости с начальными признаками обугливания (объект № 5: 250—300 °С/2 ч) матричная активность ДНК вообще не детектируется даже на уровне самого короткого ампликона (84 п.о. ДНК Y-хромосомы). Таким образом, в нашем эксперименте приемлемый для генотипирования уровень матричной активности хромосомной ДНК (в пределах диапазона чувствительности используемого метода не менее 0,01 нг/мкл) наблюдается только в препарате, полученном из костной ткани, подвергавшейся достаточно мягкой термической обработке — 100 °С/2 ч (объект № 2). В объекте № 3 (еще 1 ч при 200 °C добавочно к условиям объекта № 2) уровень матричной активности ДНК уже неприемлемо низкий. Это означает, что установить достоверный генетический профиль в таком объекте едва ли возможно (и это при том, что сама кость внешне почти не изменилась по сравнению с нативной (см. рис. 3).

Для наглядности мы выполнили процедуру генотипирования для первых 5 объектов. Полученные результаты (электрофореграммы) приведены на рис. 4 (см.).

Рис. 4. Результаты генотипирования первых пяти экспериментальных объектов. Электрофореграммы: а — интактная кость (объект № 1); б — объект № 2 (100°С/2 часа).

Рис. 4. Результаты генотипирования первых пяти экспериментальных объектов (продолжение). Электрофореграммы: в — № 3 (100°С/2 часа + 200°С/1 час), г — № 4 (250°С/1 час), д — № 5 (250°С/1 час + 300°С/1 час).

Рис. 4. Результаты генотипирования первых пяти экспериментальных объектов (продолжение). Электрофореграммы: д — № 5 (250°С/1 час + 300°С/1 час).

Видно, что генотип объекта № 2 идентичен генотипу нативной кости № 1 (см. рис. 4, а и б). Это означает, что прогрев при 100 °C в течение 2 ч не наносит ущерба генетическому материалу костной ткани (отмечаем, что и визуально такое термическое воздействие остается незаметным).

Наоборот, в объекте № 5 никакие аллели (индивидуальные признаки) не детектируются — это полностью согласуется с результатами определения матричной активности ДНК. Такая кость абсолютно непригодна для молекулярно-генетического идентификационного анализа. Напомним, что этот костный фрагмент подвергся термическому воздействию при 250—300 °С/2 ч и демонстрирует начальную стадию обугливания (см. рис. 3). Совершенно очевидно, что любое более жесткое термическое воздействие приведет к такому же негативному результату. Поэтому остальные фрагменты, доведенные в эксперименте до стадии черного, серого и белого каления, генотипировать бессмысленно — их следует признать заведомо непригодными для молекулярно-генетического идентификационного анализа.

Но подобная очевидная непригодность — это еще не самое большое зло, с точки зрения экспертизы. Не столько опасно отсутствие результата, сколько недопустим неправильный, ложный результат.

Посмотрим на электрофореграммы объектов № 3 (200 °С) и № 4 (250 °С/1 ч) (см. рис. 4, в и г). Здесь получены так называемые неполные профили ДНК — когда определяется только часть тестируемых признаков, а остальные признаки (аллели) утрачены. (Отметим, что этот результат был предопределен очень низким значением матричной активности ДНК: его причиной является то, что в таком препарате присутствует «испорченная» ДНК — в данном случае из-за термического воздействия — высокодеградированная, химически измененная.) Но, может быть, можно использовать эту сохранившуюся часть признаков для целей идентификации? Тем более, что оба этих частичных генотипа не пересекаются, т. е. они взаимно дополняют друг друга, и значит, из двух можно составить более полный один — ведь это фрагменты одной и той же кости…

Но, внимание: генотип объекта № 3, как это было изначально, — мужской, а вот № 4 — уже женский (?!). И если сравнить оба этих генотипа с истинным генотипом кости (см. рис. 4, а, в и г), то легко убедиться в том, что ни один из установленных в них в общей сложности 14 признаков не соответствует истинным: это полностью артефактный, т. е. недостоверный результат.

Обращаем внимание на то, что по внешнему виду эти кости можно принять лишь за слегка тронутые огнем (см. рис. 3). Такие объекты экспертизы требуют повышенного внимания.

Поэтому мы продолжили эксперимент, чтобы более точно определить эту потенциально опасную, с точки зрения генетической экспертизы, зону термического воздействия на кость.

В табл. 3 приведены параметры термической обработки еще трех фрагментов той же исходной кости — № 12, 13, 14. В табл. 4 : результаты определения в них эффективной концентрации ДНК. На рис. 5 (см.) представлен их внешний вид (все они мало отличаются от нативной кости). На рис. 6 (см.) приведены результаты генотипирования (электрофореграммы).

Таблица 3. Параметры термической обработки костных образцов № 12—14

Таблица 4. Эффективная концентрация ДНК в препаратах, полученных из объектов № 12—14

Рис. 5. Внешний вид фрагментов костной ткани, прошедших «мягкую» термообработку. а — объект №12 (150°С/1 час), б — №13 (150°С/2 часа), в — №14 (200°С/1 час).

Рис. 6. Результаты генотипирования. Электрофореграммы: а — объект №12 (150ОС/1 час), б — №13 (150ОС/2 часа)

Рис. 6. Результаты генотипирования.(продолжение) Электрофореграммы: в — №14 (200ОС/1 час).

Из представленных аналитических данных видно, что полный и достоверный STR-профиль демонстрирует только костный фрагмент № 12 (150 °/1 ч).

При увеличении времени действия той же температуры 150 °C до 2 ч (объект № 13) ДНК начинает быстро разрушаться, что видно по резкому падению матричной активности препарата. При попытке его генотипирования наблюдается частичная потеря истинных аллелей и искажение генотипа. Также возможно появление ложных аллелей. Установить достоверный генетический профиль в таком объекте невозможно.

При воздействии температуры 200 °C уже через 1 ч кость оказалась полностью непригодной для анализа (объект № 14). Этот результат можно рассматривать как контрольный к результату, полученному ранее для объекта № 3.

Таким образом, результаты настоящей работы заставляют с большим сомнением относиться к сообщениям об успехах, якобы достигнутых при генотипировании хромосомной ДНК в обожженных костях.

Уже температура 150 °C при воздействии в течение 2 ч может превратить кость в совершенно непригодный для генотипирования объект, полностью утративший свои индивидуальные генотипические признаки или же исказивший их до неузнаваемости. При этом визуально такая кость почти неотличима от нативной, и если не известны обстоятельства, ее вряд ли будут считать обожженной.

Если же объектом генотипирования является костный материал, термическое воздействие на который вполне очевидно — например, кость находится в стадии обугливания, то надо отчетливо понимать, что в таком объекте установить достоверный генетический профиль практически невозможно.

В этом контексте обсуждать возможность генотипирования костных останков в состоянии выраженного черного, а также серого и белого каления просто лишено смысла. Это заведомо невозможно.

Отдельно отметим, что хотя в настоящей работе речь идет о генотипировании хромосомной ДНК, основные выводы можно отнести и к митохондриальной (мт)ДНК — как минимум на том основании, что размер ампликонов, получаемых для секвенирования мтДНК, сравним с размером ампликонов, анализируемых при генотипированииSTR-локусов хромосомной ДНК. Особенности генотипирования мтДНК в обожженных костях нами сейчас специально изучаются. Результаты будут опубликованы.

Авторы выражают благодарность лаборанту отдела молекулярно-генетических экспертиз (исследований) РЦСМЭ М.Н. Лизунову за помощь в выполнении отдельных экспериментов.

Конфликт интересов отсутствует.

Список литературы:

  1. Gill P, Ivanov P, Kimpton C, Piercy R, Benson N, Tully G, Evett I, Hagelberg E, Sullivan K. Identification of the remains of the Romanov family by DNA analysis. Nature Genetics. 1994;6(2):130-135. doi: 10.1038/ng0294-130
  2. Davoren J, Vanek D, Konjhodzić R, Crews J, Huffine E, Parsons T. Highly Effective DNA Extraction Method for Nuclear Short Tandem Repeat Testing of Skeletal Remains from Mass Graves. Croat Med J. 2007;48:478-485.
  3. Земскова Е.Ю., Квачева Ю.Е., Ковалев А.В., Иванов П.Л. Смерть Ясира Арафата: молекулярно-генетическая аутентификация останков как необходимое условие оценки медицинских гипотез причины его смерти. Судебно-медицинская экспертиза. 2015;6(58):4-13. doi: 10.17116/sudmed20155864-13
  4. Amory S, Huel R, Bilic´ A, Loreille O, Parsons T. Automatable full demineralization DNA extraction procedure from degraded skeletal remains. Forensic Science International. 2012;6(3):398-406. doi: 10.1016/j/fsigen.2011.08.004
  5. Романов С.В., Смоляницкий А.Г., Молин Ю.А. Судебно-медицинская идентификация представителей семьи Демидовых. Судебно-медицинская экспертиза. 2014;3:25-28.
  6. Медико-криминалистическая идентификация. Настольная книга судебно-медицинского эксперта. Под общ. ред. Томилина В.В. М.: Издательская группа «НОРМА-ИНФРА». 2000;348-350.
  7. Schmidt CW, Symes SA, eds. The Analysis of Burned Human Remains, 2nd edition. Amsterdam—Boston—Heidelberg—London—New-York—Oxford—Paris—San Diego—San Francisco—Singapore—Sydney—Tokyo: Elsevier/Academic. 2015.
  8. Михайлов В.С., Сапожников М.А., Шафранский Л.Л. Судебно-медицинское значение исследования зубов человека методом инфракрасной спектрофотометрии. (Учебное пособие). Алма-Ата. 1987;9-16.
  9. Schwark Т, Heinrich A, Preuβe-Prange A, Wurmb-Schwark N. Reliable genetic identification of burnt human remains. Forensic Science International: Genetic. 2011;5:393-399. doi: 10.1016/j.fsigen.2010.08.008
  10. Davis T, Phillips MS. Reliable Genetic Identification of Burned Human Remains. Intro Criminal Justice. 2013 April. CJ-1010-007
  11. Velzen IV, Shaw M, Raveendran M, Gonzalez-Rodriguez J. Predictive Models as Screening Tools for DNA Recovery from Baked and Burned Porcine Bones. Austin J Forensic Sci Criminol. 2015;2(3):1029.
  12. ISSN: 2380-08
  13. Imaizumi K, Taniguchi K, Ogawa Y. DNA survival and physical and histological properties of heat-induced alterations in burnt bones. Int J Legal Med. 2014;128:439-446. doi: 10.1007/s00414-014-0988-y
  14. Imaizumi K. Forensic investigation of burnt human remains. Research and Reports in Forensic Medical Science-2015. Dovepress. National Research Institute of Police Science, Kashiwa, Japan.
  15. RRFMS https://www.dovepress.com/forensic-investigation-of-burnt-human-re... doi: 10.2147/RRFMS.S75141
  16. Zapico S, Garriga J, Ubelaker D. Efficiency of human DNA Isolation and STR Profiling from burnt teeth. HIDS Poster 2015. Доступно по ссылке https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/Documents/PDFs/HIDS%20Poster%202015red_Sara%20Casado-Zapico_final_March%202015.pdf Ссылка активна на 21.08.2016
  17. Fredericks JD, Bennett P, Williams A, Rogers KD. FTIR spectroscopy: A new diagnostic tool to aid DNA analysis from heated bone.. Forensic Science International: Genetics. 2012;6:375-380. doi: 10.1016/j.fsigen.2011.07.014
  18. AmpFlSTR Identifiler PCR Amplification Kit. User Guide. Applied Biosystems, USA. 2012. Доступно по ссылке http://www3.appliedbiosystems.com/cms/groups/applied_markets_support/documents/generaldocuments/cms_041201.pdf Ссылка активна на 21.08.2016
  19. PowerPlex 21 System. Instructions for Use of Products. Technical Manual. Promega, USA. Доступно по ссылке worldwide.promega.com/~/media/files/resources/protocols/technical%20manuals/101/powerplex%2021%20system%20protocol.pdf Ссылка активна на 21.08.2016
  20. Zheng T, Yi S, Guangfeng Z, Wanshui L. A New DNA Extraction Method for Burned Bones. Forensic Science And Technology. 2016;4(1):77-79. doi: 10.16467/j.1008-3650.2016.01.017