Особенности распределения 4-метоксигидроксибензола в организме теплокровных животных при летальных отравлениях

4-метоксигидроксибензол (син.: п-метоксифенол, 4-гидроксианизол, монометиловый эфир гидрохинона, п-гваякол, меквинол, далее — 4-МОГОБ;мол. масса 124,14) — биологически активное вещество, оказывающее депигментирующее и антиоксидантное действие [1, 2].

Известно использование4-МОГОБв качестве полупродукта синтеза 2-гидрокси-5-метоксибензальдегида, ингибитора преждевременной полимеризации полиэфирных и эпоксидных смол. Описана возможность применения 4-МОГОБ в медицине для лечения больных со злокачественной меланомой, а также в косметологии.

Рассматриваемое веществоможет являться примесью в 4-метоксиамфетамине, который иногда нелегально продается под видом наркотика 3,4-метилендиокси-N-метамфетамина (MDMA, или «Экстази») [3—6].

По физическим свойствам 4-МОГОБ — бесцветные ромбические кристаллы с температурой плавления 53 °C (по другим данным 56 или 55—58 °С), температура кипения 243°С; обладает запахом карамели и фенола. Растворимость 4-МОГОБ в воде составляет 2,573 г/100 г (при температуре 20 °C) или 40 г/1000 мл (при температуре 25 °C). Легко растворим в этаноле, бензоле, диэтиловом эфире [7]; рКа составляет 10,21 (25 °C, вода), токсичен для теплокровных организмов; обладает почечной и печеночной токсичностью.

LD50 вещества для белых крыс при внутрижелудочном введении составляет 1600 мг/кг, для мышей и кроликов при внутрибрюшинном введении — 250 и 720—790  мг/кг соответственно [3].

Описаны случаи отравления (в том числе с летальным исходом) метоксипроизводными гидроксибензола, к которым относится и 4-МОГОБ[8—10].

Токсические свойства 4-МОГОБ, его применение в медицине, косметологии, органическом синтезе, присутствие в фальсификатах запрещенных наркотиков группы амфетамина обусловливают важное судебно-химическое значение этого вещества. Многие вопросы химико-токсикологического анализа 4-МОГОБостаются практически не изученными. Так, недостаточно изучены особенности распределения данного вещества в организме теплокровных.

Цель работы — изучение особенностей распределения 4-МОГОБ в организме всеядных теплокровных животных (крысы) при летальных отравлениях, вызванных его внутрижелудочным введением.

Исследовали 4-метоксигидроксибензол (4-МОГОБ) фирмы «Sigma-Aldrich» (США) с содержанием основного вещества 99% и более.

Исследования проводили на лабораторных животных (крысы) породы Wistar. Использовали методики, примененные ранее для изучения распределения некоторых алкил- и метоксигидроксибензолов [9, 11].

Крысам-самцам 4-месячного возраста (5 опытных групп по 5 особей в каждой, массой тела 220—235 г) внутрижелудочно вводили тройную LD50 отравляющего вещества (1600 мг/кг 3 раза) в виде водной суспензии. После гибели животных трупы вскрывали, одинаковые органы и биожидкости, взятые от животных внутри каждой из групп, объединяли и исследовали на присутствие в них 4-МОГОБ. Параллельно исследовали органы и биожидкости животных контрольной группы, включающей 5 особей.

Изолирование. Определенное количество мелко измельченных (до 0,2—0,5 см) тканей органа или биожидкости заливали двукратным по массе количеством этилацетата. Смесь выдерживали 45 мин при периодическом перемешивании. Извлечение сливали с твердого остатка, процесс настаивания повторяли. Оба извлечения объединяли в выпарительной чашке, растворитель испаряли в токе воздуха при температуре 18—22 °С до незначительного объема, а затем в токе азота до получения сухого остатка.

Очистка извлечений. Остаток, полученный после испарения этилацетата из объединенного извлечения, растворяли в 1,5—2,0 мл смеси растворителей гексан—диоксан—пропанол-2 (20:5:1). Полученный раствор вносили в стеклянную колонку размером 490×11 мм, заполненную 10 г силикагеля типа L 40/100 мкм. После полного вхождения раствора в слой сорбента в колонку начинали добавлять подвижную фазу — смесь растворителей гексан—диоксан—пропанол-2 (20:5:1). Фракции элюата по 2 мл каждая собирали в отдельные пробирки.

По 5—10 мкл каждой фракции наносили на хроматографическую пластину типа Силуфол UV-254 и хроматографировали в присутствии вещества-свидетеля в стеклянных камерах (внутренний объем около 600 см³), используя в качестве подвижной фазы смесь растворителей хлороформ—бензол (9:1). По наличию пятен на хроматограмме, величина Rf которых соответствовала таковой стандарта (0,34±0,03), определяли присутствие исследуемого вещества в той или иной фракции. Фракции элюата, содержащие 4-МОГОБ [в стандартных условиях с 8-й по 25-ю фракцию (15—50 мл)], объединяли и упаривали вначале в токе воздуха при комнатной температуре до незначительного (0,5—1,0 мл) объема, а затем в токе азота до получения сухого остатка. Остаток растворяли в 5 мл этилацетата (исходный этилацетатный раствор).

В две выпарительные чашки (№ 1 и № 2) вносили по 0,5—2,5 мл исходного раствора и испаряли растворитель в токе азота до полного удаления растворителя.

Идентификация методом ТСХ. Остаток в чашке № 1 растворяли в незначительном количестве ацетона и количественно переносили на линию старта пластины Силуфол UV-254 в виде полосы. Рядом на линию старта наносили 5—10 мкл раствора (0,08% в этаноле) вещества-свидетеля. Хроматографировали, используя элюент хлороформ-бензол (9:1). Хроматограммы проявляли в УФ-свете и идентифицировали 4-МОГОБ по величине Rf.

Далее анализируемое вещество элюировали из сорбента этанолом, идентифицировали по особенностям УФ-спектра и проводили количественное определение исходя из интенсивности поглощения в области длинноволновой полосы поглощения.

Идентификация методом УФ-спектрофотометрии. Участок хроматограммы с пятном исследуемого соединения вырезали, вносили в пробирку и элюировали вещество с 5 или 10 мл этанола, периодически перемешивая содержимое пробирки в течение 10 мин. Полученный элюат отделяли и исследовали его светопоглощение в интервале длин волн 200—360 нм. Оптическую плотность определяли с помощью спектрофотометра СФ-2000 в кюветах с длиной оптического пути 10 мм. В случае присутствия больших количеств анализируемого вещества элюат перед исследованием светопоглощения разбавляли этанолом.

Идентификация методом ГХ МС. Остаток в чашке № 2 растворяли в 2 мл дихлорметана, 4 мкл полученного раствора вводили в хроматограф фирмы «Agilent Technologies» (США) модели 6850 Network GC System с квадрупольным масс-селективным детектором модели 5973 Network. Пробу вводили c делением потока 1:2. Хроматографировали в кварцевой капиллярной колонке DB-5 MS EVIDEX размером 25 м×0,2 мм с толщиной слоя неподвижной фазы 0,33 мкм при температуре инжектора 250 °C, интерфейса детектора — 300 °C. Начальную температуру термостата колонки 70 °C поддерживали в течение 3 мин, затем повышали до 290 °C (20 °С/мин). В качестве газа-носителя применяли гелий, который подавали со скоростью 0,6 мл/мин. Масс-селективный детектор работал в режиме электронного удара (70 эВ). Диапазон сканирования соответствовал интервалу масс 40—500 m/z. Вещество идентифицировали по совпадению масс-спектра с библиотечным (библиотека Wiley-7 nl) на 86% и более, а также по характерному времени удерживания.

При определении 4-МОГОБ сигнал регистрировали по полному ионному току с задержкой на растворитель в 3,5 мин.

Количественное определение. Принимая во внимание величину оптической плотности этанольного элюата, измеренной в области максимума длинноволновой полосы поглощения (294 нм), определяли количественное содержание 4-МОГОБспектрофотометрическим методом.

При идентификации методом ТСХ анализируемое соединение проявлялось на хроматограммах в УФ-свете в виде темных пятен на более светлом общем фоне пластины. Величина Rf анализируемого вещества (0,34±0,03) соответствовала значению Rf вещества-стандарта.

В процессе идентификации методом УФ-спектрофотометрии сравнение спектральных кривых вещества, извлеченного из биоматериала и очищенного по описанной схеме, со спектром чистого вещества в этаноле выявило сходство форм спектральных кривых и практическое совпадение положения точек экстремумов. Спектральные кривые, характеризующие светопоглощение этанольного раствора стандарта 4-МОГОБ и этого же вещества, выделенного из ряда органов подопытных животных, представлены на рис. 1. На рис. 1 видно, что на всех спектральных кривых 4-МОГОБ присутствуют полосы поглощения с максимумами в области 229±2 и 294±2 нм.

Данное вещество отсутствовало в паренхиматозных и полых органах крыс, не получавших 4-МОГОБ, а также в крови животных контрольной группы. Измеренное при длине волны 294 нм фоновое поглощение элюатов из участков хроматограмм, по площади и положению относительно линии старта соответствующих анализируемому веществу, не превышало 0,024 ед. оптической плотности (ед. о.п.) для извлечений из органов и 0,015 ед. о.п. из крови в пересчете на 5 г того или иного вида биоматериала.

На рис. 2 представлены хроматограммы исследуемого соединения, выделенного из органов с наибольшим его присутствием и хроматограмма вещества-стандарта.

Как следует из полученных результатов, при идентификации методом ГХ-МС время удерживания 4-МОГОБ совпадало со временем удерживания вещества-стандарта и составляло 8,49±0,14 мин.

На хроматограммах анализируемого соединения в области, соответствующей интервалу значений времени удерживания 8—9 мин, не обнаруживали (по сравнению с хроматограммой стандарта 4-МОГОБ) дополнительных пиков и заметного смещения базовой линии.

В масс-спектрах рассматриваемого вещества, извлеченного из различных органов отравленных животных, наблюдали сигналы характерных для 4-МОГОБ положительно заряженных частиц (ионы) с массами (m/z)27 (5,9%), 38 (7,4%), 53 (8,8%), 65 (3,9%), 81 (30,6%), 109 (92,8%), 124 (100%). Основным и молекулярным ионом для 4-МОГОБ является в данных условиях фрагментации ион 124 m/z (рис. 3).

Градуировочный график для спектрофотометрического определения 4-МОГОБ по интенсивности поглощения в среде этанола при длине волны 294 нм в данном случае можно описать уравнением: А=0,025396∙С+0,001199, где, А — оптическая плотность, С  — концентрация анализируемого вещества в фотометрируемом растворе (мкг/мл). Коэффициент корреляции более 0,99.

Относительная ошибка среднего результата при определении 4-МОГОБ в субстанции методом УФ-спектрофотометрии не превышает 0,8% (n=6; p=0,95).

Результаты определения рассматриваемого соединения в органах и крови отравленных животных представлены в таблице.

Как видно из данных таблицы, 4-МОГОБ присутствует в неизмененном виде как в органах, так и в крови погибших животных. Наибольшее количество 4-МОГОБ (в миллиграммах на 100 г органа или биожидкости) обнаружили в желудке с содержимым (2584,92±117,47), мозге (59,49±6,05), тонкой кишке с содержимым (28,21±3,77) и почках (26,13±1,64), несколько меньшие — в сердце (23,58±1,64), селезенке (19,53±1,13) и печени (14,90±1,16) отравленных животных.

1. Изучили распределение 4-метоксигидроксибензола в организме теплокровных животных (крысы) при летальных отравлениях, вызванных однократным введением тройной LD50 вещества в желудок.

2. Установили, что исследуемое соединение присутствует в неизмененном виде в органах и крови погибших животных.

3. В наибольших количествах 4-метоксигидроксибензол в 100 г объема обнаруживали в желудке с содержимым (2584,92±117,47 мг), мозге (59,49±6,05), тонкой кишке с содержимым (28,21±3,77 мг) и почках (26,13±1,64 мг).

Конфликтинтересовотсутствует.