N-этил-3-гидрокси-2-фенил-N-(пиридин-4-ил-метил)пропанамид (торговые названия: тропикамид, мидриацил, бистропамид; МНН — тропикамид) — лекарственное средство группы м-холиноблокаторов, вызывающее кратковременный мидриаз и паралич аккомодации. В медицине применяется для расширения зрачка при исследовании глазного дна, а также при диагностике некоторых форм деменции [1—3].

В настоящее время отмечается широкое применение тропикамида в немедицинских целях. Наркозависимые люди часто используют данное вещество как недорогую фармакологическую добавку к опиатам и опиоидам перед их введением в организм для усиления состояния эйфории. Известно, что тропикамид можно применять перорально или внутривенно для достижения одурманивающего эффекта [4, 5].

Тропикамид (Мr =284,353) — белый кристаллический порошок, температура плавления — 97 °C, практически нерастворим в воде (менее 1 г в 100 г растворителя), растворим в этаноле и ДМСО (5,7 г в 100 г растворителя), хорошо растворяется в хлороформе и ацетоне. Токсичен в отношении теплокровных животных и человека. LD50 для крыс составляет 865 мг/кг при пероральном и 1210 мг/кг при внутрибрюшинном введении, для мышей при тех же путях введения соответственно 565 и 695 мг/кг.

Токсические свойства данного вещества, его применение в лечебной практике, активное использование в немедицинских целях индивидуально и в смесях с наркотическими и сильнодействующими веществами, большое количество отравлений в результате подобного использования тропикамида вызывает интерес к нему как к важнейшему объекту судебно-химического исследования [6, 7].

Химико-токсикологическое значение тропикамида очевидно, однако отдельные вопросы его судебно-химического анализа остаются недостаточно разработанными. В частности, требует дальнейшего изучения характер распределения соединения в организме теплокровных [5, 6].

Цель исследования — изучение особенностей распределения N-этил-3-гидрокси-2-фенил-N-(пиридин-4-ил-метил)пропанамида (тропикамид) в организме всеядных теплокровных животных (крысы) при внутрижелудочном введении.

Объектом исследования явился N-этил-3-гидрокси-2-фенил-N-(пиридин-4-ил-метил)пропанамид (тропикамид) (РСО с содержанием основного вещества не менее 99%; определено методом неводного титрования: Фармакопея США. М.: ГЭОТАР-Медиа. 2009;1789).

Изучали распределение тропикамида в организме крыс в различные промежутки времени после его введения (20 мин, 2,5 и 6 ч). В каждом случае 25 крысам-самцам породы Wistar 5-месячного возраста (5 опытных групп по 5 особей в каждой) массой тела 290—305 г средство вводили через зонд в желудок (1300 мг на 1 кг массы тела — полуторная LD50) в виде смеси водного раствора и водной суспензии однократно. После декапитации животных через заданное время их трупы вскрывали, одинаковые органы и биожидкости, взятые от животных внутри каждой из групп, объединяли и исследовали на наличие в них тропикамида. Параллельно исследовали органы и биожидкости животных контрольной группы (5 особей), которым в желудок вводили дистиллированную воду [8].

Изолирование. Биологический орган, измельченный ножницами до размеров 0,2—0,5 см, или кровь заливали двукратным по массе количеством ацетона, но не менее 4 мл. Смесь выдерживали 45 мин, периодически перемешивая. Ацетоновое извлечение отделяли от твердого остатка, а процесс настаивания повторяли. Извлечения объединяли в выпарительной чашке, растворитель испаряли.

Очистка извлечений. Остаток, полученный после испарения ацетона из объединенного извлечения, растворяли в 5 мл 6% раствора щавелевой кислоты, полученный раствор переносили в делительную воронку, подщелачивали 10% раствором натрия гидроксида до рН 9,0 и экстрагировали 2 раза порциями хлороформа по 5 мл каждая. Хлороформные экстракты объединяли, фильтровали через двухслойный бумажный фильтр, фильтрат упаривали в выпарительной чашке в токе воздуха при температуре 18—22 оС до сухого остатка. Затем остаток растворяли в 5 мл хлороформа. По 0,5—2,0 мл полученного раствора вносили в две выпарительные чашки (№ 1 и № 2) и испаряли растворитель.

Идентификация методом ТСХ. Остаток в чашке № 1 растворяли в небольшом (0,4—0,6 мл) объеме ацетона и количественно переносили на линию старта хроматографической пластины Сорбфил марки ПТСХ-АФ-В-УФ в виде полосы. Хроматографировали, используя подвижную фазу гексан-диоксан-пропанол-2 (10:5:1), в присутствии вещества-свидетеля. Хроматограммы проявляли в УФ-свете. Тропикамид идентифицировали по величине Rf=0,70.

Идентификация методом УФ-спектрофотометрии. После идентификации методом ТСХ пятно анализируемого вещества вырезали из хроматограммы и элюировали вещество 5 мл 95% этанолом в течение 15 мин. Элюат отделяли и исследовали его светопоглощение при длине волны 190—360 нм, используя спектрофотометр СФ-2000, в кварцевых кюветах с длиной оптического пути 10 мм. Раствор сравнения — элюат, полученный в контрольном опыте. Если концентрация анализируемого вещества была высокой, элюат перед измерением оптической плотности разбавляли 95% этанолом. Извлечения из органов и крови животных контрольных групп исследовали по той же схеме, что и извлечения из биологических объектов, взятых у отравленных животных.

Идентификация с применением хромогенных реакций. Этанольный элюат после исследования его методом УФ-спектрофотометрии делили на две равные части (по 2,5 мл каждая), вносили каждую часть в отдельную выпарительную чашку и испаряли растворитель в чашках, получая сухие остатки, А и Б, после чего исследовали их с помощью хромогенных реакций.

Исследование по реакции образования аци-нитросоли. К остатку, А добавляли 0,5 мл 10% раствора калия нитрата в 94% серной кислоте, выдерживали реакционную смесь 5 мин при перемешивании, разбавляли 1 мл воды и обрабатывали 5 мл 20% раствора натрия гидроксида.

Исследование по реакции с красителем метиловым оранжевым. Остаток Б растворяли в 2,5 мл хлороформа, полученный раствор переносили в пробирку, туда же вносили 1 мл 0,1% раствора метилового оранжевого, 1,5 мл буферного раствора рН 3,0 и встряхивали содержимое пробирки в течение 1 мин.

Идентификация методом хромато-масс-спектрометрии (ГХ МС). Остаток в чашке № 2 растворяли в 2—4 мл хлороформа. При необходимости (в случае присутствия больших количеств анализируемого вещества) раствор разбавляли хлороформом. Затем 2 мкл хлороформного раствора вводили в газовый хроматограф Маэстро Г.Х. модели 7820 с квадрупольным масс-селективным детектором Agilent Technologi 5975. Пробы вводили без деления потока. Условия анализа: колонка кварцевая капиллярная HP-5MS (30 м×0,25 мм×0,25 мкм); температура инжектора 260 оC, интерфейса детектора 280 оС; начальная температура термостата колонки 90 оС, затем температура колонки изменяется от 90 до 280 оС со скоростью 20 оС/мин; температура квадруполя составляет 150 оС, источника ионов —230 оС; газ-носитель — гелий, подаваемый со скоростью 23,10 мл/мин с задержкой на растворитель 3 мин. Масс-селективный детектор работал в режиме электронного удара (70 эВ). Сигнал регистрировали по полному ионному току. Диапазон сканирования 40—500 m/z. Вещество идентифицировали по характерному времени удерживания (10,04 мин) и совпадению масс-спектра с библиотечным на 86% и более.

Количественное определение. По площади хроматографического пика с временем удерживания 10,04 мин на хроматограммах, полученных при идентификации анализируемого соединения методом ГХ МС по описанной схеме, определяли количественное содержание тропикамида, используя уравнение градуировочного графика.

При идентификации методом ТСХ анализируемое вещество проявляли на хроматограммах в УФ-свете (темное пятно на более светлом общем фоне пластины). Величина Rf его составляла 0,70±0,03, что соответствовало величине Rf стандарта тропикамида.

В процессе идентификации методом УФ-спектрофотометрии сравнивали спектральные кривые тропикамида, извлеченного из органов животных и очищенного по описанной ранее схеме, со спектром чистого вещества в 95% этаноле (рис. 1). Обнаружили совпадение формы спектральной кривой и положения точек экстремумов в области 206±2 и 256±1 нм.

При идентификации хромогенной реакцией нитрования и последующего получения аци-нитросоли в присутствии тропикамида наблюдали желтое окрашивание реакционного раствора.

В процессе идентификации хромогенной реакцией с красителем метиловым оранжевым хлороформный слой после экстракции приобретал желто-оранжевое окрашивание в присутствии анализируемого соединения.

При исследовании извлечений из тканей органов, содержимого желудка и кишечника, а также крови крыс, не получавших тропикамида, установили отсутствие в них рассматриваемого соединения. Измеренное при длине волны 256 нм фоновое поглощение элюатов из участков контрольных хроматограмм в пересчете на извлечение из 5 г одинаковых органов животных не превышало 0,018 усл. ед. оптической плотности.

При идентификации методом ГХ МС время удерживания анализируемого соединения совпадало с таковым вещества-стандарта и составило (10,04±0,09 мин) (рис. 2, 3).

В масс-спектрах присутствовали сигналы осколков (заряженные частицы), характерных для молекулы тропикамида с 44, 65, 92, 121, 137, 163, 183, 209, 225, 254, 284 m/z (см. рис. 2, 3). Основным (интенсивность которого принимается за 100%) является осколок с m/z 92. В масс-спектре присутствует молекулярный ион (m/z 284).

Уравнение градуировочного графика для количественного определения тропикамида методом ГХ МС в данном случае имеет вид: S = 499730∙C+6485, где S — площадь хроматографического пика; C — концентрация определяемого вещества в анализируемой пробе, нг.

Линейный участок графика соответствует интервалу концентраций 0,1—100 нг в хроматографируемой пробе.

Относительная ошибка среднего результата при определении тропикамида в субстанции методом ГХ МС не превышает 1,69% (n=6; p=0,95).

Результаты определения тропикамида в органах и крови отравленных животных, погибших через различные промежутки времени после введения отравляющего агента в желудок, представлены в таблице. Как видно из данных таблицы, через 20 мин после введения наибольшое количество тропикамида обнаружили в содержимом (486,43±94,56) и ткани (281,49±31,18) желудка, в содержимом (24,47±3,75) и ткани (19,89±1,78) тонкой кишки, а также в селезенке (18,28±2,44). Через 2,5 ч после введения наибольшее количество исходного отравляющего вещества находили в ткани (529,27±88,99) и содержимом (313,74±83,53) желудка, мозге (193,50±18,67), содержимом (178,05±33,81) и ткани (31,01±2,44) тонкой кишки, в легких (24,94±1,69), селезенке (19,01±2,20) и печени (10,71±2,10). Спустя 6 ч после введения тропикамид в большем количестве присутствовал в ткани желудка (492,90±90,64) и его содержимом (211,84±45,78), в легких (24,37±3,73), ткани тонкой кишки (23,71±2,83) и ее содержимом (21,35±3,48), в мышцах (14,71±1,70), сердце (8,69±1,22) и селезенке (6,74±1,21).

1. Изучили распределение N-этил-3-гидрокси-2-фенил-N-(пиридин-4-ил-метил)пропанамида в организме теплокровных животных (крысы) через различные промежутки времени после однократного введения его в количестве 1300 мг/кг в желудок.

2. Установили, что наибольшее количество исходного отравляющего вещества тропикамида (в миллиграммах в 100 г биоматериала) содержалось в ткани желудка (281,49—529,27) и его содержимом (211,84—486,43), ткани тонкой кишки (19,89—31,01) и ее содержимом (21,35—178,05), мозге (0,046—193,50), легких (0,79—24,94), селезенке (6,74—19,01) животных.

Кофликт интересов отсутствует.