Наиболее распространенными объектами экспертного исследования являются потожировые следы (ПЖС) человека. При исследовании ДНК ПЖС пальцев рук не всегда удается получить полный генетический профиль по различным причинам: малое количество биологического материала, неблагоприятные условия окружающей среды, криминалистическая обработка следов отпечатков пальцев [1].

Приказом Минздравсоцразвития России № 346н от 12.05.10 «Об утверждении порядка организации и производства судебно-медицинских экспертиз в государственных судебно-экспертных учреждениях Российской Федерации» регламентировано «для обоснованного вывода о безусловном исключении причастности идентифицируемого лица к происхождению исследованных объектов несовпадение аллельных профилей должно быть зарегистрировано как минимум для двух несцепленных локусов (в некоторых случаях с учетом конкретных обстоятельств исключающий вывод может быть обоснован при однолокусном несовпадении гетерозиготных профилей)» (п. 84.11.6.) [2].

При работе с биологическими объектами, содержащими крайне малое количество генетического материала, в том числе ПЖС пальцев рук, в результате типирования часто выявляют неполный генетический профиль. В таких случаях возможны отсутствие результатов энзиматической амплификации отдельных локусов ДНК, наличие дополнительных («фантомные») аллелей, выпадение аллелей (эффекты «ложной гомозиготы») [3]. В связи с этим при отсутствии объектов сравнения интерпретация результатов исследования генетических профилей такого рода объектов очень затруднительна [4]. Возникает необходимость выполнения многоэтапных исследований ДНК, что может быть также неинформативно из-за малого количества активной ДНК-матрицы. В подобных случаях выявление полного генотипа отпечатков пальцев напрямую зависит от способа изъятия ПЖС с различных поверхностей.

Цель исследования — установление зависимости между сроком нахождения ПЖС на поверхности гладкого металлического предмета, способом изъятия и результатами их сравнительного генотипирования.

Для экспериментального молекулярно-генетического исследования получили материал от 20 человек (10  мужчин и 10 женщин). Объект исследования — ДНК ПЖС пальцев рук на поверхности гладкого металлического предмета. Для сравнительного генотипирования использовали ДНК буккального эпителия испытуемых.

Отпечатки подушечек пальцев обеих рук испытуемых наносили на стерильный гладкий металлический предмет однократно. Изъятие биологического материала проводили с помощью фрагментов клейкой ленты размером 1×1 см путем однократной аппликации и смывов ватными тампонами, смоченными в лизирующем буфере набора реагентов PrepFiler (Lysis buffer) [5] площадью 1 см² сразу после нанесения отпечатков, через 24 ч, 7 и 30 дней. В ходе эксперимента исследуемый металлический предмет находился в условиях комнатной температуры, без прямого попадания лучей солнечного света и контакта с посторонними объектами.

ДНК выделяли с помощью автоматической станции AutoMate Express/Life Technologies DNA Extraction System (США) «Applied Biosystems», США, согласно инструкции [6]. Конечный объем выделенной ДНК составлял 50 мкл.

Количество выделенной ДНК определяли на термоциклере с мультиканальным детектором для оценки ПЦР-продуктов в режиме реального времени (РВ) iQ5 (США) Bio-Rad. Для энзиматической амплификации локуса гена HBG (Human beta globin) длиной 120 нуклеотидных пар (н.п.) использовали следующую пару праймеров [7]:

HBG1: 5’-GCTTCTGACACAACTGTGTTCACTAGC-3’

HBG2: 5’-CACCAACTTCATCCACGTTCACC-3’.

Регистрацию накопления ампликонов в РВ и построение калибровочных кривых проводили по технологии выполнения РВ-ПЦР, основанной на связывании фрагментов двухцепочечной ДНК с интеркалирующим красителем EVA Green. Для этого использовали базовый набор реактивов для проведения РВ-ПЦР в присутствии интеркалирующего красителя EVA Green. Перед ПЦР в пробирки с 22 мкл готовой реакционной смесью добавляли по 3 мкл выделенной ДНК или стандартных препаратов ДНК с известными концентрациями.

Проводили амплификацию в следующем режиме:

95 °C 3 мин

55 °C 30 с 40 циклов

55—95 °С 15 с Плавление с шагом 0,5 °С (81 цикл)

Эффективность РВ-ПЦР, вычисленная по стандартной кривой, составила 92,3% (R2=0,988) (табл. 1).

Данные ПЦР в РВ анализировали с помощью программы iQ5 Optical System Software (версия 2.0, 2006). Температура плавления искомого ПЦР-продукта составляла 84,5±0,5 оС.

При качественной и количественной оценке препаратов ДНК из ПЖС в различные сроки их нанесения получили специфичные ПЦР-продукты. На фотографии электрофореза отчетливо виден амплифицированный фрагмент гена HBG размером 120 н.п. (рис. 1).

Генотипирование ДНК проводили по STR-локусам панели AmpFℓSTR IdentifilerPlus: (D3S1358, vWA, FGA, D8S1179, D21S11, D18S51, D5S818, D13S317, D7S820, CSF1PO, THO1, D16S539, D2S1338, D19S433, TPOX) и локусу Amelogenin, определяющему половую принадлежность, в 20 параллелях [8]. Амплификацию ДНК осуществляли методом ПЦР на термоциклере GeneAmp PCR System 9700 («Applied Biosystems»). Электрофорез образцов проводили с помощью ДНК-анализатора ABI PRISM 3130xl (США) «Applied Biosystems» в соответствии с руководством по использованию [9].

Для статистической обработки экспериментальных данных о количестве ДНК в препаратах использовали программу STADIA [10]. Соответствие типа распределения выборок нормально оценивали путем проверки нулевой гипотезы об отсутствии различий между выборочным и нормальным распределениями по критериям Колмогорова—Смирнова, w-квадрат и χ2. Распределение всех выборок отличалось от нормального, поэтому вместо средних арифметических и стандартных ошибок средних рассчитывали медиану и квартили. Для оценки различий между двумя выборками по признаку, измеренному в количественной шкале (количество ДНК в препаратах, полученных с помощью различных методов изъятия ПЖС), использовали непараметрические критерии различия в сдвиге (положении): статистика Вилкоксона и Ван дер Вардена.

Выявили постепенное снижение концентрации ДНК с течением времени, что можно объяснить ее деградацией. Концентрация ДНК ПЖС, изъятых с помощью фрагмента клейкой ленты, практически не отличалась от ПЖС, изъятых с помощью смывов (табл. 2, 3).

При проверке различий между выборками c помощью критериев Вилкоксона, Ван дер Вардена и критерия знаков установили отсутствие достоверных различий в значениях концентраций ДНК, выделенных из ПЖС путем нанесения на клейкую ленту и путем смыва. Единственные различия были в концентрациях ДНК, полученных из ПЖС спустя 7 сут после их нанесения. Так, с помощью клейкой ленты (скотч) удалось извлечь из ПЖС ДНК почти в 3 раза больше, чем путем смыва.

Таким образом, статистические расчеты показали, что метод изъятия ПЖС (на клейкую ленту или путем смыва) не имеет никакого значения.

Результаты генотипирования зависели от способа изъятия биологического материала, что было заметно уже спустя 1 нед (табл. 4). Так, при отборе ПЖС с помощью клейкой ленты удалось получить полный генетический профиль непосредственно после нанесения отпечатков, через сутки и через неделю во всех параллелях. При изъятии ПЖС тем же способом спустя 1 мес в 4 из 10 параллелей выявить полный генотип не представилось возможным. В 8 из 15 локусов наблюдали эффекты выпадения аллелей и отсутствие продуктов энзиматической амплификации, еще в 2 локусах, наоборот, отмечали вставку дополнительных аллелей (так называемый эффект ложной смеси ДНК).

При проведении смывов ПЖС с поверхности гладкого металлического предмета спустя 1 нед после оставления отпечатков выявили нехарактерные для референсных образцов аллели в 6 локусах (всего 8 ложных, «фантомных» аллелей), через 1 мес — в 7 локусах (всего 10 «фантомных» аллелей). В этих случаях отмечали эффекты выпадения аллелей (эффект «ложной гомозиготы») и отсутствие продуктов энзиматической амплификации (рис. 2).

Не обнаружили какой-либо зависимости выявленных эффектов от размеров исследуемых локусов ДНК. Данные результаты можно объяснить не наличием каких-либо ингибиторов в ПЖС [11, 12], а уменьшением концентрации исходной ДНК-матрицы в образцах с течением времени.

Результаты эксперимента показали, что при сравнительном исследовании генотипа конкретного лица с генотипом, полученным из ПЖС пальцев рук, оставленных более 1 нед назад, возрастает вероятность получения ложных результатов генотипирования по 1 локусам и более.

При интерпретации генетических профилей такого рода объектов необходимо исключить как ложноотрицательные выводы в экспертизах (исключение причастности идентифицируемого лица к происхождению исследованных объектов), так и ложноположительные, когда эксперт принимает ложные («фантомные») аллели за истинные и делает вывод о наличии смеси ДНК разчных людей в объекте, в котором на самом деле эта так называемая смесь отсутствует. Появление «лишних» аллелей обусловлено крайне низкой концентрацией ДНК-матрицы.

При исследованиях ПЖС, кроме крайне низкого содержания биоматериала, практически во всех случаях необходимо учитывать возможность наличия смеси ДНК в объекте.

В случае несовпадения аллельных состояний по двум и более локусам, а конкретно несовпадения аллелей подозреваемого с генетическим профилем ПЖС, можно сделать вывод об исключении происхождения следа от данного лица. При отсутствии аллелей подозреваемого в профиле ПЖС, вызванном низкой концентрацией матричной ДНК, эксперту следует делать некатегорический вывод о не исключении возможности происхождения следа от данного лица либо о непригодности результатов для сравнительного исследования. В случае появления «фантомных» аллелей возможно проведение стандартного вычисления вероятности участия лица в смесевом генетическом профиле.

Для достоверного подтверждения либо исключения тождества исследуемых профилей необходимо осуществлять генетический анализ объекта, изъятого с помощью клейкой ленты или смыва, в нескольких параллелях.

Конфликт интересов отсутствует.