Химико-токсикологический анализ сертиндола

В судебной токсикологии антипсихотические препараты представляют значительный интерес, который объясняется возможными злоупотреблениями ими и на этом фоне отравлениями и суицидами [1]. Одним из препаратов этой группы является сертиндол - "атипичный" нейролептик, который эффективно используется для лечения больных шизофренией в США, Европе, а в последнее время и в России. В соответствии с профилем рецепторной активности сертиндол оказывает влияние на продуктивную и негативную симптоматику как при коротких курсах терапии, так и при курсах средней длительности. Низкое сродство с мускариновыми холинергическими, а также гистаминовыми рецепторами в комбинации с высоким аффинитетом к 5НТ6-рецепторам, вероятно, объясняет положительное влияние на когнитивные функции, что находит подтверждение в экспериментальных и клинических исследованиях. Некоторые аспекты токсикокинетики сертиндола, несмотря на его благоприятный терапевтический профиль [2], требуют дальнейшего изучения. Для точного установления диагноза отравления сертиндолом требуется разработка способов его изолирования, а также применение надежных методик его обнаружения в объектах небиологического и биологического происхождения.

Цель исследования - изучение влияния различных факторов на изолирование сертиндола из растворов; разработка методик его изолирования из биологических объектов, а также методик обнаружения и количественного определения в извлечениях из объектов.

Методики исследования. По химической структуре сертиндол - (1-[2-[4-[5-хлоро-1-(4-фторфенил)-индол-3-ил]-1-пиперидил]этил]имидазолидин-2-он) - представляет собой производное

Экстракцию сертиндола органическими растворителями проводили по следующей методике: 1 мл раствора сертиндола в 96% этаноле с концентрацией 400 мкг/мл (оптимальная концентрация при использовании спектрофотометрической методики для определения сертиндола) помещали в коническую колбу вместимостью 25 мл, добавляли 0,1 М раствор кислоты хлористоводородной до рН 6,0; 5,0; 4,0; 3,0; 2,0 или 25% раствор аммиака до рН 8,0; 9,0; 10,0; 11,0; 12,0; 13,0; 14,0 и 3 мл органического растворителя. Содержимое колбы взбалтывали и помещали в делительную воронку. После разделения фаз отделяли слой органического растворителя. Растворители удаляли при комнатной температуре. Сухие остатки, полученные после испарения экстрагента, растворяли в 5 мл 96% этанола. 2,5 мл полученного раствора помещали в мерную колбу вместимостью 50 мл и доводили 96% этанолом до метки. Количественное содержание сертиндола определяли спектрофотометрическим методом при длине волны 260 нм на спектрофотометре СФ-56. Степень извлечения сертиндола (Х, %) рассчитывали по удельному показателю поглощения, полученному экспериментально.

Изучение влияния электролита, времени и кратности экстракции проводили по аналогичной методике, изменяя соответствующие параметры экстракции.

Распределение сертиндола во внутренних органах и биологических жидкостях изучали на белых мышах обоего пола массой 22-30 г. Уход за животными и их содержание осуществляли в соответствии с требованиями приказа Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации №708н от 23.08.10 "Об утверждении Правил лабораторной практики". Сертиндол вводили в виде суспензии в желудок в токсической концентрации 400 мкг/кг [3]. Мочу собирали в течение суток. Признаки острого отравления сертиндолом чаще всего наблюдаются в течение первых суток, поэтому по истечении 24 ч животных вводили в наркоз, декапитировали и отбирали внутренние органы и кровь.

Изолирование сертиндола из печени, почек, головного мозга, сердца, желудка и кишечника с содержимым проводили по методу Васильевой, основанному на извлечении токсичных веществ водой, подкисленной щавелевой кислотой до рН 2,0-2,5. Экстракцию сертиндола осуществляли хлороформом из кислой и щелочной среды.

Обнаружение сертиндола в извлечениях методом ТСХ проводили по следующей методике [4]: на линию старта хроматографической пластины Сорбфил ПТСХ-АФ-В-УФ наносили по 20 мкл исследуемых извлечений с помощью микрошприца. Пластину с нанесенными пробами высушивали на воздухе в течение 10 мин, затем помещали в камеру с системой растворителей, предварительно насыщенную их парами в течение 30 мин, и хроматографировали восходящим способом в системах растворителей: толуол-ацетон-этанол-25% раствор аммиака (45:45:7,5:2,5), бензол-этанол-25% раствор аммиака (50:10:0,5), этанол-

25% раствор аммиака (100:1,5). После прохождения фронта растворителей 10 см пластину вынимали и сушили на воздухе в течение 15 мин. Детекцию пятен проводили с помощью УФ-света при длине волны 254 нм.

Обнаружение сертиндола в извлечениях методом УФ-спектрофотометрии проводили по следующей методике [5]: сухой остаток после изолирования растворяли в 10 мл 96% этанола. Затем 2,5 мл полученного раствора помещали в мерную колбу вместимостью 50 мл и доводили 96% этанолом до метки. Спектр полученного раствора регистрировали в области 200-300 нм на спектрофотометре при длине рабочего слоя 1 см.

Для обнаружения и количественного определения сертиндола в извлечениях из внутренних органов, плазмы крови и мочи методом ВЭЖХ использовали хроматографическую колонку размером 2×75 мм, заполненную обращенно-фазовым сорбентом ProntoSil 120-5-C 18 AQ; подвижная фаза: элюент А - 0,1% раствор трифторуксусной кислоты, элюент Б - ацетонитрил; скорость потока 100 мкл/мин; время измерения 0,18 с; температура термостата колонки комнатная, объем пробы 5 мкл, длина волны 230 нм [6]. Количественное содержание сертиндола в извлечениях рассчитывали по стандартному образцу.

Статистическую обработку данных проводили с помощью пакета программ EL.

Для разработки эффективной методики изолирования сертиндола из различных биологических объектов первоначально изучили влияние некоторых факторов (природа органического растворителя, рН среды, влияние электролита, кратность и время экстракции) на его изолирование из растворов. Зависимость степени извлечения сертиндола от природы растворителя (метиленхлорид, этилацетат, бензол, толуол, четыреххлористый углерод, хлороформ и смесь бутилацетат:бутанол 9:1) и рН среды (данные 6 определений) представлена на рис. 1

Установлено, что оптимальным органическим растворителем для экстракции сертиндола из растворов является хлороформ, который экстрагирует исследуемое вещество при рН 6,0 и 10,0. Нами выбрано значение рН 10,0 для проведения извлечений в качестве оптимального, так как сертиндол извлекается при этом значении в максимальном количестве. Этилацетат и бензол сертиндол не экстрагируют.

Для изучения влияния электролита на степень извлечения сертиндола использовали наиболее часто применяемые электролиты (табл. 1

Полученные данные свидетельствуют о том, что раствор натрия карбоната насыщенный оказывает высаливающее действие на сертиндол, а раствор натрия сульфата 5% - всаливающее действие.

Увеличение времени экстракции сертиндола с 3 до 7 мин приводит к увеличению количества изолируемого вещества с 72,26 до 73,25%. Кратность экстракции оказывает незначительное влияние на степень экстракции сертиндола.

Полученные данные использовали для разработки методики изолирования сертиндола из плазмы крови и мочи.

Методика изолирования сертиндола из плазмы крови: к 0,2 мл центрифугата добавляли 25% раствор аммиака до рН 10,0 и затем 1 мл раствора натрия карбоната насыщенного и 3 мл хлороформа. Содержимое взбалтывали в течение 7 мин и помещали в делительную воронку. Экстракцию повторяли 2 раза порциями по 3 мл хлороформа. После разделения фаз отделяли слой органического растворителя. Растворители удаляли при комнатной температуре. Сухие остатки, полученные после испарения экстрагента, растворяли в 5 мл 96% этанола.

Методика изолирования сертиндола из мочи: к 0,5 мл мочи добавляли 0,2 мл концентрированной хлористоводородной кислоты и кипятили в течение 1 ч на водяной бане. После охлаждения добавляли 25% раствор аммиака до рН 10,0 и 1 мл натрия карбоната насыщенного и 3 мл хлороформа. Содержимое взбалтывали в течение 7 мин и помещали в делительную воронку. Экстракцию повторяли 2 раза порциями по 3 мл хлороформа. После разделения фаз отделяли слой органического растворителя. Растворители удаляли при комнатной температуре. Сухие остатки, полученные после испарения экстрагента, растворяли в 5 мл 96% этанола.

Распределение сертиндола на внутренних органах лабораторных животных при остром отравлении изучали через 24 ч после его перорального введения. Для обнаружения сертиндола в извлечениях использовали физико-химические методы: ТСХ, УФ-спектрофотометрию и ВЭЖХ.

Для ТСХ-скрининга сертиндола изучали его хроматографическую подвижность в системах хлороформ-ацетон (9:1); этанол-вода-25% раствор аммиака (8:1:1); хлороформ-диоксан-ацетон-25% раствор аммиака (45:47,5:5:2,5); толуол-ацетон-этанол-25% раствор аммиака (45:45:7,5:2,5); диоксан-хлороформ-ацетон-25% раствор аммиака (47,5:45:5:2,5); ацетонитрил-изопропанол-вода (5:3:2). Для предварительного исследования сертиндола выбрали систему растворителей толуол-ацетон-этанол-25% раствор аммиака (45:45:7,5:2,5), так как Rf =0,79±0,02. Для основного исследования сертиндола изучали возможность использования следующих хроматографических систем: толуол-ацетон-25% раствор аммиака (50:10:5); этанол-25% раствор аммиака (100:1,5); хлороформ-ацетон (90:10); метиленхлорид-метанол-25% раствор аммиака (85:15:1); этилацетат-25% раствор аммиака-уксусная кислота (26:1,6:3,3); хлороформ-метанол (10:1); этилацетат-хлороформ-25% раствор аммиака (85:10:5); бензол-этанол-25% раствор аммиака (50:10:0,5); метанол-25% раствор аммиака (100:1,5).

Рекомендуем пользоваться системой растворителей этилацетат-25% раствор аммиака-уксусная кислота (26:1,6:3,3) и бензол-этанол-25% раствор аммиака (50:10:0,5) для проведения основного исследования сертиндола, а систему этанол-25% раствор аммиака (100:1,5) целесообразно применять для хроматографической очистки, так как пятно сертиндола располагается в средней хроматографической зоне, что позволяет отделить обнаруживаемое вещество от соэкстрактивных.

УФ-спектр стандартного раствора сертиндола в 96% этаноле характеризуется максимумом поглощения при длине волны 225±2 и 260±2 нм и минимума при 243±2 нм (рис. 2

Обнаружение сертиндола в извлечениях с помощью УФ-спектрофотометрии проводили после предварительной хроматографической очистки.

При обнаружении сертиндола методом ВЭЖХ на хроматограмме стандартного раствора обнаружен один основной пик со временем удерживания 12 мин (рис. 3

Время удерживания сертиндола на хроматограм-

мах извлечений совпадало с таковым стандартного образца.

Количественное определение сертиндола в извлечениях из внутренних органов и биологических жидкостей проводили методом ВЭЖХ. Данные и статистическая обработка результатов определения сертиндола в печени, почках и мозге представлены в табл. 2

Полученные данные свидетельствуют, что в течение 24 ч после острого отравления в максимальном количестве сертиндол накапливается в печени (9,99±1,29%) и в мозге (11,97±2,59%). В почках, желудке и кишечнике с содержимым его меньше, а в извлечениях из сердца сертиндол не накапливается. На основании результатов исследования рекомендуем в качестве оптимального биологического объекта при исследовании внутренних органов на наличие сертиндола использовать печень и мозг.

Кровь и моча являются предпочтительными биологическими жидкостями при химико-токсикологических исследованиях у живых лиц (табл. 3

Таким образом, максимальная степень экстракции сертиндола по истечении 24 ч наблюдалась из плазмы крови (25,25±1,77%). В моче сертиндол в неизмененном виде обнаруживался в концентрации 3,11±0,46%.

1. Разработаны методики обнаружения и количественного определения сертиндола в извлечениях из биологических объектов методами УФ-спектрофотометрии, ТСХ и ВЭЖХ.

2. Изучено влияние факторов экстракции (природа органического растворителя, рН среды, природа электролита, кратность и время экстракции) на изолирование сертиндола из растворов.

3. Предложены оптимальные биологические объекты для проведения судебно-химического анализа сертиндола: печень и головной мозг.

4. Разработаны методики изолирования сертиндола из биологических жидкостей (плазма крови, моча), которые валидированы по следующим показателям: прецизионность, правильность, предел количественного определения и степень извлечения.

Конфликт интересов отсутствует.