Особенности распределения 2,6-ди-трет-бутил-4-метилгидро­ксибензола в организме теплокровных животных

2,6-ди-трет-бутил-4-метилгидроксибензол (далее 2,6­-­­ДТБ-4-МГОБ; мол.м. 220,34) - биологически активное вещество, оказывающее антиоксидантное и цитостатическое действие [1-3].

2,6-ДТБ-4-МГОБ применяется в медицине и ветеринарии в составе различных препаратов. Его также вводят в качестве присадки в технические, например трансформаторные, масла. Как добавка Е321 используется при производстве пищевых продуктов [4-6].

2,6-ДТБ-4-МГОБ - белое кристаллическое вещество с температурой плавления 68,5-70 ^оС, со слабым характерным запахом. Растворимость 2,6-ДТБ-4-МГОБ в воде составляет 0,6 мг/л при температуре 25 °C. Он легко растворим в толуоле, растворим в углеводородах, метаноле, этаноле, изопропаноле, ацетоне, бензоле, метилэтилкетоне, петролейном эфире, целлозольве, растительных маслах [7, 8].

рКа вещества составляет 12,23 (25 °C). 2,6-ДТБ-4-МГОБ токсичен для теплокровных организмов. При пер­оральном введении LD50 вещества для крыс составляет 1700-1970, или 890 мг/кг; для мышей - 650 мг/кг, LD100 для кошек - 940-2100 мг/кг; LD50 2,6-ДТБ-4-МГОБ для мышей при внутрибрюшинном и внутривенном введении составляет соответственно 138 и 180 мг/кг [9].

Токсические свойства 2,6-ДТБ-4-МГОБ, широкое применение в медицине, пищевой промышленности и различных областях техники позволяют рассматривать его в качестве потенциального объекта химико-токсикологического исследования. 2,6-ДТБ-4-МГОБ требует дальнейшего изучения. Так, например, недостаточно изучены особенности распределения данного вещества в организме теплокровных.

Цель исследования - изучение особенностей распределения 2,6-ДТБ-4-МГОБ в организме всеядных теплокровных животных (крысы) при отравлениях, вызванных внутрижелудочным введением данного вещества.

Исследовали 2,6-ДТБ-4-МГОБ фирмы "Acros orga­nics" (США) с содержанием основного вещества 99,8%.

Исследования проводили на крысах в соответствии с методиками, примененными ранее для изучения распределения ряда других моно- и полиалкилгидроксибензолов [10, 11].

В каждом случае 25 крысам-самцам породы Wistar 4-месячного возраста (5 опытных групп по 5 особей с массой 190-230 г в каждой) вводили внутрижелудочно через зонд тройную LD50 отравляющего вещества (1785 мг/кг×3) в виде водной суспензии. После гибели подопытных организмов трупы вскрывали, одинаковые органы и биожидкости, взятые от животных внутри каждой из групп, объединяли и исследовали на присутствие в них 2,6-ДТБ-4-МГОБ. Параллельно исследовали органы и биожидкости животных контрольной группы, состоящей из 5 особей.

Изолирование. Определенное количество мелкоизмельченных (размером до 0,2-0,5 см) тканей органа или биожидкости заливали двукратным по массе количеством этилацетата, но не менее 4 мл (3,6 г). Смесь выдерживали 45 мин при периодическом перемешивании. Извлечение сливали с твердого остатка, процесс настаивания повторяли. Оба извлечения объединяли в выпарительной чашке, растворитель испаряли в токе воздуха при температуре 18-22 оС до незначительного (0,5-1,0 мл) объема, а затем в токе азота до получения сухого остатка.

Очистка извлечений. Остаток, полученный после испарения этилацетата из объединенного извлечения, растворяли в 1,0-1,5 мл смеси гексан-ацетон (9,5:0,5). Раствор вносили в стеклянную колонку размером 490×11 мм, заполненную 10 г силикагеля типа L 40/100 мкм. После полного вхождения раствора в слой сорбента в колонку добавляли элюент - гексан-ацетон (9,5:0,5). Элюат собирали фракциями по 2 мл каждая в отдельные пробирки. По 5-10 мкл каждой фракции наносили на хроматографическую пластину типа Сорбфил ПТСХ-АФ-А-УФ и хроматографировали в присутствии вещества-свидетеля в стеклянных камерах с внутренним объемом около 600 см3, используя подвижную фазу хлороформ-бензол (9:1). По наличию пятен на хроматограмме, величина Rf которых соответствовала таковой стандарта (0,75±0,04), определяли присутствие исследуемого вещества в той или иной фракции. Фракции элюата, содержащие 2,6-ДТБ-4-МГОБ (в стандартных условиях с 5-й по 8-ю фракцию; 9-16 мл), объединяли и упаривали вначале в токе воздуха при комнатной температуре до незначительного (0,5-1,0 мл) объема, а затем в токе азота. Сухой остаток растворяли в 5 мл этилацетата (исходный раствор).

В две выпарительные чашки (№1 и №2) вносили по 0,5-2,5 мл исходного раствора и испаряли растворитель в токе азота до его полного удаления.

Идентификация методом ТСХ. Остаток в чашке №1 растворяли в незначительном количестве ацетона и количественно переносили на линию старта пластины Сорбфил ПТСХ-АФ-А-УФ в виде полосы. Рядом на линию старта наносили 5-10 мкл раствора (0,08% в этаноле) вещества-свидетеля. Хроматографировали, используя элюент хлороформ-бензол (9:1). Хроматограммы проявляли в УФ-свете. 2,6-ДТБ-4-МГОБ идентифицировали по величине Rf.

В дальнейшем анализируемое вещество элюировали из сорбента этанолом, идентифицировали по УФ-спектру и проводили количественное определение по интенсивности поглощения в области длинноволновой полосы поглощения.

Идентификация методом УФ-спектрофотометрии. Участок хроматограммы с пятном исследуемого соединения вырезали, помещали в пробирку и элюировали вещество 5 или 10 мл этанола, периодически перемешивая содержимое пробирки в течение 10 мин. Элюат отделяли и исследовали его светопоглощение в интервале длин волн 200-360 нм. Оптическую плотность измеряли на спектрофотометре СФ-2000 в кюветах с длиной оптического пути 10 мм. В случае присутствия больших количеств анализируемого вещества элюат предварительно разбавляли этанолом.

Идентификация методом ГХ МС. Остаток в чашке №2 растворяли в 2 мл дихлорметана, 4 мкл полученного раствора вводили в хроматограф фирмы "Agilent Technologies" (США) модели 6850 Network GC System с масс-селективным детектором модели 5973 Network. Пробу вводили c делением потока 1:2. Хроматографировали в кварцевой капиллярной колонке DB-5 MS EVIDEX (25 м×0,2 мм) со слоем неподвижной фазы (5% фенил-метилполисилоксан) толщиной 0,33 мкм. Температура инжектора составляла 250 ^оC, интерфейса детектора - 300 ^оС. Начальную температуру термостата колонки (70 ^оС) поддерживали в течение 3 мин, затем ее повышали до 290 ^оC со скоростью 20 ^оC/мин. В качестве подвижной фазы использовали гелий, который подавали со скоростью 0,6 мл/мин. Масс-селективный детектор работал в режиме электронного удара (70 эВ). Диапазон сканирования 40-500 m/z. Анализируемое соединение идентифицировали по характерному времени удерживания, а также по совпадению масс-спектра с библиотечным (библиотека Wiley-7nl) на 86% и более.

При определении 2,6-ДТБ-4-МГОБ сигнал регистрировали по полному ионному току с задержкой на растворитель 3,5 мин.

Количественное определение. По величине оптической плотности этанольного элюата, измеренной в области максимума длинноволновой полосы поглощения (282 нм), определяли количественное содержание 2,6-ДТБ-4-МГОБ спектрофотометрическим методом.

При идентификации методом ТСХ анализируемое соединение проявлялось на хроматограммах в УФ-свете в виде темных розово-фиолетовых пятен на более светлом общем фоне пластины. Величина Rf анализируемого вещества (0,75±0,04) соответствовала величине Rf вещества-стандарта.

В процессе идентификации методом УФ-спектро­фотометрии сравнение спектральных кривых вещества, извлеченного из биоматериала и очищенного по приведенной ранее схеме, со спектром чистого вещества в этаноле выявило совпадение форм спектральных кривых и положения точек экстремумов (рис. 1

В извлечениях из тканей внутренних органов и крови крыс, не получавших 2,6-ДТБ-4-МГОБ, данное вещество отсутствовало в паренхиматозных и полых органах, а также в крови животных контрольной серии. Измеренное при длине волны 282 нм фоновое поглощение элюатов из участков хроматограмм, по площади и положению относительно линии старта соответствующих анализируемому веществу, не превышало 0,026 ед. опт. п. для извлечений из органов и 0,018 из крови в пересчете на 5 г того или иного вида биоматериала (рис. 2

При идентификации методом ГХ МС время удерживания 2,6-ДТБ-4-МГОБ совпадало со временем удерживания вещества-стандарта и составляло 10,52±0,12 мин.

На хроматограммах анализируемого соединения в области, соответствующей интервалу значений времени удерживания 9,5-11,5 мин, не обнаруживали (по сравнению с хроматограммой вещества-стандарта) дополнительных пиков и заметного смещения базовой линии.

В масс-спектрах исследованного вещества, извлеченного из различных органов отравленных животных, присутствовали сигналы характерных осколков (заряженные частицы) для молекулы 2,6-ДТБ-4-МГОБ с массами (m/z) 41 (7,1%), 57 (16,4%), 91 (8,9%), 105 (9,9%), 115 (7,5%), 145 (14,5%), 177 (8,5%), 205 (100%) и 220 (23,1%). Основной ион - 205 m/z, молекулярный ион - 220 m/z (рис. 3

Градуировочный график для спектрофотометрического определения 2,6-ДТБ-4-МГОБ по интенсивности поглощения в среде этанола при длине волны 282 нм в данном случае описывается уравнением: А=0,009882·С-0,004147, где А - оптическая плотность, С - концентрация анализируемого вещества в фотометрируемом растворе (мкг/мл). Коэффициент корреляции >0,99.

Относительная ошибка среднего результата при определении 2,6-ДТБ-4-МГОБ методом УФ-спектро­фото­метрии не превышает 0,9% (n=6; p=0,95).

Результаты определения рассматриваемого соединения в органах и крови отравленных животных представлены в таблице

Как видно из данных таблицы

1. Установили присутствие 2,6-ди-трет-бутил-4-метилгидроксибензола в неизмененном виде в органах и крови погибших животных.

2. Наибольшие количества 2,6-ди-трет-бутил-4-метилгидроксибензола обнаруживается в желудке с

содержимым (787,78±52,31), тонкой кишке с содержимым (18,31±3,47), селезенке (12,46±1,02) и почках (8,48±0,61).

Конфликт интересов отсутствует.