Карбосульфан [2,3-дигидро-2,2-диметилбензофуран-7-ил (дибутил-аминотио)метилкарбамат] используется как инсектицид и нематоцид системного и контактного действия для борьбы с листогрызущими и почвообитающими насекомыми-вредителями. Это вязкая желто-бурая жидкость со специфическим запахом, разлагающаяся при температуре выше 150 °C [1, 2]. Один из основных метаболитов карбосульфана в организме теплокровных — карбофуран (2,3-дигидро-2,2-диметилбензофуран-7-ил-N-метилкарбамат). Он самостоятельно применяется как инсектицидный протравитель системного типа против почвообитающих и наземных вредителей [1, 2, 5]. Карбофуран имеет вид бесцветных кристаллов или белого кристаллического порошка, его температура плавления 153—154 °С [1, 2, 5].

Рассматриваемое соединение токсично для теплокровных организмов. При пероральном введении крысам ЛД50 карбосульфана составляет 138 мг/кг, его технического продукта — 250 мг/кг [6].

По данным литературы [3, 5], с увеличением времени, прошедшего с момента отравления карбосульфаном, его концентрация снижается, а в тканях и биологических жидкостях может накапливаться карбофуран. Вопросы распределения карбосульфана и карбофурана в органах и биожидкостях теплокровных организмов до настоящего времени остаются малоизученными.

Цель исследования — изучение особенностей распределения карбосульфана в организме теплокровных животных (крысы).

Основной объект исследования — карбосульфан [2,3-дигидро-2,2-диметилбензофуран-7-ил (дибутил-аминотио)метилкарбамат] с содержанием основного вещества 99,9% [СОП 42−06, производитель НПК БЛОК-1 (НИИХСЗР)]. Дополнительный объект — карбофуран (2,3-дигидро-2,2-диметилбензофуран-7-ил-N-метилкарбамат) с содержанием основного вещества 99,9% и более [ГСО 7710−99, производитель НПК БЛОК-1 (НИИХСЗР)].

Для изучения распределения карбосульфана 25 крысам-самцам линии Wistar 4-месячного возраста (5 опытных групп по 5 особей в каждой) с массой 180—230 г через зонд вводили в желудок анализируемое вещество в количестве 420 мг на 1 кг массы животного (тройная ЛД50) в виде водной эмульсии однократно. После гибели животных трупы вскрывали, одинаковые органы и биожидкости, взятые от животных в каждой группе, объединяли и исследовали на наличие в них карбосульфана и его метаболита карбофурана. Параллельно исследовали органы и биожидкости животных контрольной группы (5 особей), которым вводили в желудок дистиллированную воду без анализируемых веществ.

Изолирование. Измельченную биологическую ткань (размер частиц 3—5 мм) заливали двукратным по массе количеством системы растворителей ацетон-этилацетат (1:1 по объему), но не меньше чем 4 г. Смесь выдерживали 30 мин при периодическом перемешивании. Изолирующий агент сливали с твердого остатка, а процесс настаивания повторяли. Извлечения объединяли, растворитель отгоняли [7].

Очистка извлечений. Остаток в чашке растворяли в 3 мл ацетона, смешивали полученный раствор с 1,5 г силикагеля КСС 80/120 мкм и после испарения растворителя вносили данную смесь в стеклянную хроматографическую колонку размером 490×10 мм, предварительно заполненную 8,5 г силикагеля КСС 80/120 мкм. Хроматографировали, используя подвижную фазу гексан-диоксан (8:2 по объему). Высоту столба элюента поддерживали в процессе хроматографирования на уровне 28—29 см от верхнего края столба сорбента (скорость элюирования около 0,3 мл/мин). Элюат собирали фракциями по 2 мл. В отдельных выпарительных чашках объединяли фракции, содержащие то или иное анализируемое вещество, после чего элюент из каждой чашки испаряли в токе воздуха при температуре 17—22 °С до получения сухого остатка. Сухой остаток в каждой чашке растворяли в 10 мл ацетона, получая раствор, А (в нем возможно присутствие карбосульфана) и раствор Б (в нем возможно присутствие карбофурана). По 1,0—2,5 мл каждого из полученных растворов вносили в отдельные выпарительные чашки (А1, А2, Б1, Б2) и испаряли растворитель.

Идентификация методом обращенно-фазовой ТСХ. Каждый из остатков в чашках А1 и Б1 растворяли в незначительном объеме этилацетата и количественно переносили на линию старта хроматографической пластины Сорбфил ПТСХ-АФ-В-УФ, обработанной вазелиновым маслом (модель привитой фазы C14—C15). Хроматографировали, используя элюент ацетонитрил — буферный раствор рН 1,98 (6:4 по объему) в присутствии веществ-свидетелей (карбосульфан и карбофуран). Хроматограммы проявляли в УФ-свете. Вещества идентифицировали по величине Rf.

Идентификация методом УФ-спектрофотометрии. После идентификации методом ТСХ пятно того или иного анализируемого вещества вырезали из хроматограммы и элюировали 5 мл этанола в течение 15 мин. Элюат отделяли и определяли его светопоглощение в интервале длин волн 190—340 нм, используя спектрофотометр СФ-56, в кварцевых кюветах с длиной оптического пути 10 мм. Раствор сравнения — элюат, полученный в контрольном опыте. В случае большой концентрации анализируемого вещества элюат предварительно разбавляли этанолом. Извлечения из органов животных контрольных групп исследовали по той же схеме, что и извлечения из внутренних органов отравленных животных.

Идентификация методом ГХ МС. Содержимое каждой из чашек А2 и Б2 растворяли в 5 мл дихлорметана. При большой концентрации анализируемых веществ полученные растворы разбавляли. Далее брали по 2—4 мкл полученных растворов на исследование. Исследование проводили на хроматографе фирмы «Agilent Technologies» (США) модели 6850 Network GC System с масс-селективным квадрупольным детектором модели 5973 Network этой же фирмы. Хроматографировали в кварцевой капиллярной колонке DB-5 MS EVIDEX длиной 25 м, внутренним диаметром 0,2 мм с неподвижной фазой 5%-фенил-95%-метилполисилоксан при толщине пленки неподвижной фазы 0,33 мкм.

Детектор работал в режиме электронного удара (70 эВ). Обнаружение вещества проводили в режиме регистрации по полному ионному току с задержкой 3,5 мин (диапазон сканирования 40—500 m/z).

Количественное определение. По величине оптической плотности этанольного элюата, измеренной при 281 нм (для карбосульфана) или 282 нм (для карбофурана), определяли количественное содержание того или иного вещества, используя уравнение градуировочного графика.

Для очистки карбосульфана и карбофурана методом прямофазной колоночной хроматографии от соэкстрактивных веществ биоматериала использовали подвижную фазу гексан-диоксан (8:2 по объему), позволяющую очистить и отделить анализируемые вещества друг от друга в процессе хроматографирования. Первым из колонки элюировался карбосульфан (фракции 4—8), затем карбофуран (фракции 9—17).

При идентификации методом ТСХ хроматограммы проявляли в УФ-свете. Величина Rf карбосульфана составляла 0,47±0,03; карбофурана 0,77±0,03, что соответствовало величине Rf стандартов.

В процессе идентификации методом УФ-спектрофотометрии при сравнении спектральных кривых карбосульфана и карбофурана, извлеченных из органов животных и очищенных по описанной ранее схеме, со спектром чистого вещества в этаноле (рис. 1) обнаружили совпадение формы спектральной кривой и положения точек экстремумов: в области 209 и 281 нм для карбосульфана (А) и в области 211 и 282 нм для карбофурана (Б).

При исследовании извлечений из тканей органов и крови крыс, не получавших карбосульфана и карбофурана, данные вещества в них отсутствовали. Измеренное при 281 и 282 нм фоновое поглощение элюатов из участков контрольных хроматограмм в пересчете на извлечение из 5 г одинаковых органов животных не превышало 0,003—0,010 усл. ед. оптической плотности.

Для определения карбосульфана и его метаболита методом ГХ МС предложены условия, при которых температура инжектора составляла 250 °C, температура интерфейса детектора — 300 °C, начальная температура термостата колонки — 70 °C, время при начальной температуре — 3 мин, скорость нагрева термостата колонки — 20 °С/мин, конечная температура термостата — 290 °С, время при конечной температуре — 20 мин. Газ-носитель — гелий, подаваемый со скоростью 0,6 мл/мин. Ввод пробы в режиме с делением потока 1:2. В данных условиях на хроматограммах наблюдали пик (время удерживания 16,2 мин), соответствующий карбосульфану (рис. 2, а), и пик (время удерживания 9,7 мин), соответствующий карбофурану (рис 3, а).

Масс-спектр, соответствующий пику с временем удерживания 16,2 (см. рис. 2, б), включал сигналы ряда осколков (заряженные частицы) с характерными массами: 41, 57, 76, 91, 118, 135, 160, 164, 323 и 380 m/z. Основным, масса которого принимается за 100%, являлся осколок с массой 160 m/z. Масс-спектр, соответствующий пику с временем удерживания 9,7 мин (см. рис. 3, б), включал сигналы ряда осколков с характерными массами: 41, 51, 77, 91, 103, 122, 131, 149, 164 и 221 m/z. Основным, масса которого принимается за 100%, являлся осколок с массой 164 m/z.

Подобное сочетание сигналов характерных осколков вещества с временем удерживания позволяет с высокой селективностью идентифицировать анализируемые вещества методом ГХ М.С. Значения открываемого минимума карбосульфана и карбофурана составляют при этом соответственно 0,2·10^–9 и 1·10^–9 г в хроматографируемой пробе.

Уравнения градуировочных графиков для фотометрического определения карбосульфана и карбофурана по поглощению в УФ-области спектра соответственно имели вид: А = 0,008444·С + 0,003344 и, А = 0,01496·С – 0,00519, где, А — оптическая плотность, С — концентрация анализируемого вещества в фотометрируемом растворе (мкг/мл). Относительная ошибка среднего результата при определении карбосульфана методом фотометрии составила 0,87% (n=5; p=0,95), при определении карбофурана — 0,79% (n=5; p=0,95).

Результаты определения карбосульфана и карбо-фурана в органах отравленных животных представлены в табл.  1 и 2. Как видно из данных табл. 1, карбосуль-фан в наибольших количествах присутствовал в желудке с содержимым, тонкой и толстой кишке с содержимым, печени, легких. Несколько меньшие его количества содержались в почках, сердце, селезенке. Один из основных его метаболитов — карбофуран обнаруживался в желудке с содержимым и тонкой кишке с содержимым, сердце, легких, селезенке (см. табл. 2). В толстой кишке, почках, мышцах, крови, толстой кишке с содержимым карбофуран присутствовал в меньших количествах.

1. Изучили распределение карбосульфана в организме теплокровных животных (крысы) при однократном внутрижелудочном введении 1000 мг/кг данного вещества в желудок.

2. Установлено, что в предлагаемых условиях введения данного отравляющего вещества его наибольшие количества (в мг/100 г) присутствуют в желудке с содержимым (414,1±49,0), тонкой (259,0±29,4) и толстой (22,9±2,4) кишке с содержимым, печени (172,3±40,1) и легких (27,2±3,2).

3. Помимо исходного отравляющего вещества в организме погибших животных обнаруживался его метаболит карбофуран. Присутствие последнего (в мг/100 г) отмечалось в наибольшей степени в желудке с содержимым (34,2±1,9) и тонкой кишке с содержимым (12,4±1,0), сердце (15,5±1,1), легких (11,3±0,9) и селезенке (12,1±0,8).

Конфликт интересов отсутствует.