О стабильности образцов крови, иммобилизованных на FTA-картах при их длительном хранении

С 1998 г. в Ростовском филиале 111-го Главного государственного центра судебно-медицинских и криминалистических экспертиз Минобороны России (ранее 124-я Центральная лаборатория медико-криминалистической идентификации МО РФ) для идентификации военнослужащих, погибших в зонах боевых конфликтов на Северном Кавказе, начали активно использовать молекулярно-генетические методы [1, 2]. Тогда же в лаборатории было организовано хранение биологических образцов (сухая кровь) родственников военнослужащих, погибших или пропавших без вести, на бумажных носителях с FTA-матриксом (карточки FTA и FITZCO, Whatman Technology, США). В настоящее время на хранении в лаборатории остается 586 образцов, из которых 65% (381 образец) - это FTA-карты.

Производитель гарантирует сохранность сухой крови на FTA-носителе в течение не менее 22 лет (в терминах сохранности ДНК) [3, 4]. Кроме этого, по информации разработчика, применение FTA-бумаги в качестве материала-носителя для образцов крови позволяет не только длительно хранить эти образцы, но и легко и быстро очищать ДНК от примесей белков и железосодержащих соединений. Связанная с FTA-матриксом ДНК освобождается от гема и других ингибиторов в полимеразной цепной реакции (ПЦР) простым отмыванием специальным реагентом (FTA-реагент). После этого FTA-бумагу с иммобилизованной на ней ДНК вводят непосредственно в амплификационную смесь.

Ряд исследователей [5] сообщили о недостаточной эффективности FTA-карт при длительном хранении биологических образцов. В частности, при 7-летнем хранении цельной крови на FTA-картах при температуре 37 °С, по всей видимости, происходит деградация высокомолекулярных STR-локусов [6]. ДНК буккального эпителия после 7-летнего хранения на FTA-носителе при комнатной температуре также не сохраняет свои исходные качественные и количественные характеристики [7].

С другой стороны, работы ряда авторов [8, 9] свидетельствуют о положительном опыте применения FTA-карт в практике судебно-медицинского анализа ДНК.

Ранее, в 2002 г., мы провели оценку эффективности использования FTA-карт для целей ДНК-идентификации военнослужащих, погибших в ходе боевых действий на территории Чеченской Республики [10].

Цель настоящей работы - изучение качественных и количественных характеристик препаратов ДНК, полученных из сухой крови после ее 15-летнего хранения на FTA-картах при комнатной температуре (24-28 °С).

На I этапе работы оценивали эффективность метода пробоподготовки, рекомендованного фирмой-производителем FTA-карт, а именно отмывки иммобилизованной ДНК с помощью FTA-реагента. При типировании контрольных 2-дневных образцов крови выявили полные генетические профили для всей контрольной группы из 22 человек. Матричная активность ДНК была одинаковой для всех локусов панели AmpFlSTR Identifiler Plus PCR Amplification Kit («Applied Biosystems», США).

Из 50 FTA-карт, которые хранились при комнатной температуре (24-28 °С) в течение 15 лет, получить полный генетический профиль удалось только для 41 (82%) образца. Примечательно, что во всех этих образцах матричная активность в ПЦР высокомолекулярных STR-локусов (длиной более 300 н.п.) была существенно ниже матричной активности низкомолекулярных STR-локусов (менее 300 н.п.) (рис. 1, на цв. вклейке).

Рис. 1. Интегральные электрофореграммы трех репрезентативных экспериментов по амплификации STR-локусов панели Identifiler Plus («Applied Biosystems», США) на матрице ДНК, иммобилизованной на FTA-картах, после отмывки FTA-реагентом (три образца крови 15-летней давности). Видно значительное снижение матричной активности STR-локусов длиной более 300 п.н.

В 9 (18%) из 50 образцов после стандартной отмывки FTA-реагентом 15-летних FTA-карт получили неполные генетические профили, в которых наблюдали для ряда локусов отсутствие ПЦР-продуктов, выпадение истинных и включение ложных аллелей. Какой-либо корреляции с размерами амплифицируемых STR-локусов не наблюдали. Отсутствие такой корреляции позволяет предположить, что причиной артефактов ПЦР является не столько деградация ДНК-матрицы, сколько остаточное присутствие ингибиторов активности ДНК-полимеразы в результате неполноты очистки. Действительно, даже визуальная оценка указывает, что 15-летние FTA-карты отмываются FTA-реагентом заметно хуже, чем 2-дневные образцы (рис. 2, на цв. вклейке).

Рис. 2. Внешний вид вырезок из FTA-карт после их штатной отмывки с помощью АЕФ-реагента. Слева - 15-летние образцы, справа - 2-дневные образцы.

На II этапе работы для более полного удаления ингибиторов и повышения качества препаратов вместо «штатной» очистки иммобилизованной ДНК путем отмывки FTA-реагентом использовали альтернативные методики. Осуществляли тотальное экстрагирование ДНК, иммобилизованной на FTA-картах, с применением роботизированных станций QIAcube («Qiagen», Германия) [11, 12] и АutoMate Express («Applied Biosystems», США) [13, 14].

В каждый эксперимент брали 30 вырезок диаметром 1,2 мм (общая площадь 34 мм2).

Для всех 15-летних FTA-карт удалось получить полный генетический профиль локусов панели AmpFlSTR Identifiler Plus PCR Amplification Kit («Applied Biosystems», США). Как и при «штатной» очистке, матричная активность высокомолекулярных STR-локусов (более 300 н.п.) была ниже матричной активности низкомолекулярных STR-локусов (менее 300 н.п.) (рис. 3, на цв. вклейке). Это наблюдение подтверждает выявленный ранее (при простой отмывке карт с использованием FTA-реагента) факт деградации высокомолекулярных ДНК-матриц в препаратах крови, иммобилизованных на FTA-картах, подвергшихся длительному хранению.

Рис. 3. Интегральные электрофореграммы репрезентативного эксперимента по амплификации STR-локусов панели Identifiler Plus («Applied Biosystems», США) на матрице ДНК иммобилизованной на FTA-карте в образце крови 15-летней давности, после отмывки FTA-реагентов (а), после экстрагирования с применением роботизированных станций QIAcude (б) и AutoMate Express (в).

Сравнительная количественная оценка препаратов ДНК, выделенных из 15-летних и 2-дневных образцов крови на FTA-картах с помощью приборов QIAcube и АutoMate Express, не выявила между ними существенной разницы. Оба прибора показали достаточную эффективность получения активных ДНК-матриц. Минимальная концентрация ДНК в препаратах, полученных с помощью QIAcube, была 0,20 нг/мкл для 15-летних и 1,15 нг/мкл для 2-дневных образцов (при объеме элюата 50 мкл).

Максимальная концентрация составила 5,41 и 6,32 нг/мкл соответственно. Аналогичные показатели для минимальной концентрации ДНК в препаратах, полученных на АutoMate Express, были 0,49 нг/мкл для 15-летних и 1,96 нг/мкл для 2-дневных образцов крови также при объеме элюата 50 мкл. Максимальные показатели концентрации ДНК при выделении на АutoMate Express - 4,99 нг/мкл для 15-летних и 6,34 нг/мкл для 2-дневных образцов.

Полученные нами данные свидетельствуют, что пробоподготовка для длительно хранившихся образцов крови на FTA-носителях, выполняемая по «штатному» протоколу с использованием FTA-реагента, не во всех случаях может обеспечить приемлемый результат для судебно-экспертного типирования STR-локусов хромосомной ДНК. Это в какой-то мере согласуется с данными других исследователей [7, 15, 16]. Причиной неудовлетворительных результатов может стать остаточное присутствие ингибиторов активности ДНК-полимеразы, обусловленное неполнотой такого рода очистки.

Для таких потенциально проблемных объектов предпочтительно использовать вместо рекомендованной простой отмывки FTA-матрикса альтернативные методики, заключающиеся в тотальном экстрагировании ДНК, иммобилизованной на FTA-картах, с ее последующей эффективной очисткой. Полученные результаты демонстрируют, что, в частности, количество и качество ДНК в препаратах, полученных из образцов крови, хранившихся на FTA-картах в течение 15 лет, с помощью роботизированных станций QIAcube и АutoMate Express вполне приемлемы для рутинного судебно-экспертного типирования STR-локусов хромосомной ДНК.

Следует отметить, что даже в таких препаратах матричная активность высокомолекулярных STR-локусов все-таки оказывается сниженной.

Это наблюдение подтверждает опасение, что препараты крови, иммобилизованные на FTA-картах, при их длительном хранении при комнатной температуре могут в той или иной степени подвергаться деградационным процессам.