Оланзапин - представитель атипичных антипсихотических лекарственных средств нового поколения. Он обладает рядом преимуществ перед типичными нейролептиками. Применяется для лечения больных шизофренией, при психических расстройствах с различной симптоматикой, для купирования острых маниакальных приступов и психомоторного возбуждения. Препарат обладает высокой фармакотерапевтической активностью. Оланзапин оказывает побочные действия, приводящие к отравлениям, часто заканчивающимся летальным исходом. Описано большое количество передозировок и смертных случаев, причиной которых явился оланзапин [1-5]. При интоксикациях оланзапином клиническая и патоморфологическая картина не характерны. Для установления причины отравления значение имеют результаты химико-токсикологического (судебно-химического) анализа. В настоящее время методы выделения оланзапина из биологических объектов, очистки, идентификации и количественного определения разработаны недостаточно.

Цель исследования - разработка методики определения оланзапина в трупной крови и ткани печени для использования в химико-токсикологическом анализе.

1. Определение оланзапина в трупной крови. В результате предварительных экспериментов были получены спектры абсорбции оланзапина, максимальное поглощение которого в этаноле наблюдалось при длинах волн 225 и 271 нм (последнюю длину волны выбрали в качестве аналитической). При использовании этанольных растворов 3 разных концентраций оланзапина в 3 повторностях установлена линейность УФ-спектрофотометрического определения, которая соблюдалась в пределах 2-15 мкг оланзапина в 1 мл раствора (длина волны 271 нм). При проведении ТСХ-скрининга [6] оланзапин попадает во ІІ хроматографичесую группу с индексом удерживания, равным 0,34±0,016. Определены потери оланзапина при хроматографировании и элюировании, которые составили около 7%.

Теоретические и экспериментальные исследования, проведенные ранее В.А. Карташовым [7] и Л.В. Черновой [8], показали преимущества амфифильных растворителей (метанол, этанол, ацетон, ацетонитрил и др.) для экстрагирования из биологического материала ряда веществ кислотного и основного характера. В связи с этим при выделении оланзапина из биологических объектов использовали ацетон как наиболее доступный, дешевый и менее токсичный (по сравнению с ацетонитрилом) растворитель.

Методика. По 5 г трупной крови помещали в пенициллиновые флаконы вместимостью 20 мл и добавляли по 0,5 мл рабочего стандартного образца, содержащего 400 мкг оланзапина в 1 мл раствора (к контрольным образцам печени добавляли 0,5 мл воды). Проводили по 5 параллельных и одному контрольному опыту. Содержимое флаконов перемешивали на аппарате для встряхивания при 70 колебаний в 1 мин в течение 2 ч при комнатной температуре. Далее в каждый флакон добавляли 10 мл ацетона и экстрагировали путем перемешивания на аппарате для встряхивания при 150 колебаний в 1 мин в течение 10 мин. В каждом случае ацетоновый экстракт отделяли от ткани центрифугированием при 2000 об/мин, фильтровали через небольшой ватный тампон в пенициллиновый флакон и выпаривали на водяной бане при температуре 40 °С и слабом потоке воздуха до удаления растворителя. К остатку во флаконе добавляли по 5 мл 0,1 н. раствора соляной кислоты и диэтилового эфира, содержимое тщательно встряхивали в течение 2 мин.

После разделения фаз отделяли водную фазу, подщелачивали раствором гидроксида аммония до рН 9 и экстрагировали 5 мл хлороформа. Хлороформный слой отделяли, выпаривали, сухой остаток растворяли в небольшом количестве хлороформа и количественно в виде полосы наносили на стартовую линию пластины Сорбфил. Хроматографирование проводили в системе ацетон параллельно со смесью 5 метчиков в камере, не насыщенной парами растворителя. Оказалось, что оланзапин, выделенный из крови, имеет такие же хроматографические характеристики, как стандартный образец оланзапина (рис. 1, а).

После хроматографирования оланзапин, обнаруженный с помощью реактива Драгендорфа, элюировали путем экстракции хлороформом из щелочной среды. Остаток после удаления хлороформа растворяли в 10 мл этанола, раствор спектрофотометрировали в диапазоне 200-400 нм (раствор сравнения - этанол). Полученные спектральные кривые (рис. 2, кривые 2-6)

Количественное определение оланзапина проводили согласно стандарту. Использовали величины оптических плотностей, измеренных при длине волны 271 нм (максимум поглощения оланзапина). Данные экспериментов показали, что при одноступенчатом экстрагировании в трупной крови определяется в среднем 55% оланзапина (см. таблицу).

2. Определение оланзапина в крови и печени лабораторных животных. Для апробации разработанной методики выполнили эксперименты на лабораторных животных. Использовали 3 беспородные лабораторные крысы, каждой из которых с помощью зонда в желудок вводили суспензию таблеточной массы, содержащей 50 мг оланзапина. Через 1,5 ч крыс умертвили путем передозировки эфирного наркоза и вскрыли. По 5 г печени и средней пробы крови крыс исследовали по разработанной методике.

Далее провели ТСХ-скрининг экстрактов из печени и анализ хроматограмм в УФ-свете (254 нм). Обнаружили флюоресцирующую полосу в V хроматографической группе. После обработки хроматограммы реактивом Драгендорфа проявились 3 полосы желто-оранжевого цвета (см. рис. 1, б): две полосы (1, 2) во ІІ и одна (3) в V хроматографической группе (флюоресцирующая до проявления). Следует отметить, что полоса 1 во II группе через некоторое время приобрела слабую желтоватую окраску. Вещества из каждой отмеченной полосы после элюирования исследовали УФ-спектрофотометрическим методом (рис. 3).

При исследовании экстракта из крови крыс методом ТСХ-скрининга и рассматривании хроматограммы в УФ-свете флюоресцирующей полосы в V хроматографической группе не наблюдали. После обработки этой хроматограммы реактивом Драгендорфа обнаружили 2 полосы оранжевого цвета во ІІ и ІV группах (см. рис. 1, в). Спектральные кривые веществ после элюирования с хроматограммы приведены на рис. 3. Спектр абсорбции вещества II хроматографической группы (кривая 2) совпал со спектром оланзапина. Спектральная кривая 3 вещества IV хроматографической группы была аналогична спектру поглощения метаболита оланзапина, выделенного из печени крыс.

Следовательно, из крови и печени крыс выделены два разных метаболита, которые имеют одинаковые спектральные характеристики, но различаются по хроматографической подвижности.

Были определены количества оланзапина, выделенного из печени и крови крыс, которые составили 67,6, 109,5, 105,5 и 31,1 мкг соответственно.

Показана возможность применения разработанной методики для экстракционного выделения оланзапина из трупных крови и ткани печени, его обнаружения и количественного определения. Методика апробирована в экспериментах на лабораторных животных и может быть рекомендована для определения оланзапина при химико-токсикологических исследованиях.