4-Нитроанилин (1-амино-4-нитробензол, в дальнейшем 4-НА) - соединение, широко применяющееся для синтеза красителей и некоторых лекарственных средств (нитразепам, нимесулид). 4-НА проявляет метгемоглобинобразующие свойства [1-3].

По физическим свойствам 4-НА представляет собой желтые моноклинные игольчатые кристаллы или ярко-желтый кристаллический порошок, малорастворимый в воде, хорошо растворимый в ацетоне и спирте.

Данное вещество обладает значительной токсичностью для теплокровных организмов. LD100 составляет 600 мг/кг для крыс при внутрибрюшинном введении. Описаны случаи отравления людей, в том числе с летальным исходом [4-6].

Широкое применение 4-НА, его токсичность, наличие случаев летального отравления обусловливают необходимость изучения этого соединения в судебно-химическом отношении [3, 5,].

Вопросы судебно-химического анализа 4-НА, а именно особенности изолирования из биологического материала, остаются недостаточно изученными.

Исследовали 4-НА (ч.д.а., ТУ-6-09-258-87) с содержанием основного вещества не менее 99,5%.

Изучали особенности изолирования 4-НА из биологического материала с помощью растворителей различной химической природы: водой и водными растворами (0,1 н раствор хлороводородной кислоты, 8% раствор уксусной кислоты), карбоновыми кислотами (ледяная уксусная кислота), алкилзамещенными амидами кислот (ДМФА), кетонами (ацетон), спиртами (метанол, этанол, пропанол-1), гетероциклическими кислородсодержащими соединениями (диоксан), алканами (гексан), галогеналканами (хлороформ, дихлорэтан), аренами (бензол, толуол), сложными и простыми эфирами (диэтиловый эфир, этилацетат), нитрилами (ацетонитрил). Готовили модельные смеси 4-НА (размер частиц 5-50 мкм) и мелкоизмельченной трупной печени человека (размер частиц 0,2-0,5 мм) с содержанием 12,5 мг вещества в 25 г биологического материала, которые выдерживали при 18-20 °С в течение 1,5 ч после приготовления. Осуществляли двукратное изолирование 4-НА при соотношении изолирующего агента и биологического материала 2:1 (по массе). Продолжительность каждого настаивания составляла 45 мин. Оба извлечения, полученные из каждой модельной смеси, объединяли, часть объединенного извлечения наносили на пластины типа Сорбфил с люминесцентным индикатором и хроматографировали, используя подвижную фазу гексан-ацетон в соотношении 7:3 по объему в присутствии вещества-свидетеля. На хроматограммах 4-НА проявлялся в виде темного пятна на более светлом общем фоне пластины в УФ-свете и в виде желтого пятна в видимом свете. Значение Rf составляло 0,38±0,02. Элюирование 4-НА из сорбента осуществляли диметилформамидом.

Вещество идентифицировали по особенностям поглощения диметилформамидного элюата в УФ и видимой части спектра. По величине оптической плотности элюата, измеренной в области 381,8 нм (спектрофотометр СФ-2000, длина оптического пути 10 мм), определяли количество 4-НА спектрофотометрическим методом, используя уравнение калибровочного графика, которое в данном случае имело вид:

где D - оптическая плотность; С - концентрация, мкг/мл.

График линеен в интервале концентраций 0,2-8,0 мкг/мл.

При определении 4-НА методом спектрофотометрии в субстанции относительная ошибка среднего результата не превышала 1%.

С помощью приведенной схемы изолирования, очистки и определения 4-НА исследовали зависимость степени извлечения рассматриваемого соединения из биологического материала от продолжительности контакта изолирующей жидкости с биологическим материалом, кратности настаивания и количественного соотношения изолирующего агента и биологической ткани.

Изучали особенности очистки рассматриваемого вещества, выделенного из биоматериала, методом адсорбционной колоночной хроматографии. Остаток, полученный после испарения диоксана из объединенного извлечения, растворяли в 3 мл ацетона, смешивали полученный раствор с 1,5 г силикагеля L 40/100 мкм и после испарения растворителя вносили смесь в стеклянную хроматографическую колонку размером 120×10 мм, предварительно заполненную 8,5 г силикагеля L 40/100 мкм. Содержимое колонки уплотняли путем равномерного постукивания по внешней поверхности стенок. Хроматографировали, используя подвижную фазу гексан-ацетон (8:2). В процессе хроматографирования поддерживали высоту столба элюата 28-29 см от верхнего края столба сорбента. Элюат собирали фракциями по 2 мл.

4-НА обнаруживали во фракциях методом ТСХ. Условия хроматографирования: пластины Сорбфил UV-254; подвижная фаза гексан-ацетон (7:3); наносимый на пластину объем каждой фракции 5 мкл.

Параллельно проводили контрольное хроматографирование на колонке извлечения из 25 г трупной печени человека, заведомо не содержащей 4-НА. Фракции элюата, в которых теоретически возможно присутствие анализируемого вещества, объединяли, испаряли и остаток растворяли в 10 мл ацетона. Затем 2,5 мл полученного раствора вносили в выпарительную чашку и испаряли растворитель в токе воздуха. Остаток растворяли в 25 мл ДМФА с последующим измерением оптической плотности раствора при 381,8 нм (растворитель и длина волны соответствуют условиям определения методом спектрофотометрии).

При поиске условий определения анализируемого соединения методом ВЭЖХ в качестве неподвижных фаз использовали сорбенты с гидроксилированной (силасорб-600) и привитой (диапак С-16, сепарон С-18) поверхностями, в качестве элюентов - мало- и среднеполярные системы растворителей (для нормально-фазового варианта хроматографирования) и сильнополярные системы (для хроматографирования в обращенно-фазовом режиме). Процесс хроматографирования осуществляли на приборе Милихром (завод «Научприбор», Орёл, Россия) с УФ-детектором. Для оценки хроматографического поведения 4-НА в колонке сорбента рассчитывали время удерживания (tR), объем удерживания (VR), коэффициент емкости (k′), число теоретических тарелок (N) и фактор асимметрии пика.

Результаты изолирования 4-НА из трупной печени различными растворителями представлены на рис. 1.

Максимальная степень извлечения 4-НА из трупной печени 1,4-диоксаном достигается уже при продолжительности настаивания 30 мин (рис. 2).

Определяли зависимость степени извлечения 4-НА от кратности настаивания (табл. 1).

В процессе идентификации методом УФ-спектрофотометрии при сравнении спектральных кривых 4-НА, извлеченного из биоматериала и очищенного по описанной схеме, со спектром чистого вещества в ДМФА обнаруживали совпадение формы спектральной кривой и положения точки максимума в области 381,8 нм.

Изучение хроматографического поведения 4-НА в колонке с силикагелем L 40/100 мкм показало, что при использовании подвижной фазы гексан-ацетон (8:2) анализируемое вещество присутствует в 15-32 фракциях элюата (29-64 мл).

В контрольных опытах с тканью печени, не содержащей 4-НА, установили, что фоновое поглощение части элюата, соответствующего фракциям, в которых возможно присутствие рассматриваемого вещества, незначительно и составляет 0,002-0,003 при 381,8 нм - аналитической длине волны при определении методом спектофотометрии. Полученный результат позволяет характеризовать предлагаемый вариант очистки на колонке с гидроксилированным сорбентом как достаточно эффективный.

Исследование особенностей определения 4-НА методом ВЭЖХ позволило установить, что оптимальные условия хроматографирования могут быть достигнуты при использовании неподвижной фазы силасорб-600 (колонка размером 64×2 мм) и элюента гексан-диоксан-пропанол-2 (40:5:1). Скорость подачи подвижной фазы составляла 100 мкл/мин, регистрации - 0,8 ед.о.п., время измерения  - 0,6 с. Значения оптической плотности регистрировали при длине волны 238 нм. Рассчитанные для данных условий хроматографирования значения ряда характеристик составили: 11,30 мин (время удерживания), 1130 мкл (объем удерживания), 5,46 (коэффициент емкости), 924 (число теоретических тарелок), 0,92% (фактор асимметрии пика). Открываемый минимум 4-НА методом ВЭЖХ составил 0,04 мкг в хроматографируемой пробе.

Как свидетельствуют полученные данные, на хроматограмме 4-НА, выделенного из биологического материала, при сравнении ее с хроматограммой вещества-стандарта не обнаруживаются дополнительные пики или заметное увеличение фонового поглощения. Параметры хроматографирования анализируемого соединения, выделенного из ткани трупной печени, совпадают с соответствующими параметрами стандартного вещества.

На основе результатов предварительных исследований предложена методика определения 4-НА в биологическом материале.

Изолирование. В каждом случае 25 г мелкоизмельченной трупной печени человека, содержащей определенное количество 4-НА (от 2,5 до 50,0 мг), заливали 50 г 1,4-диоксана и выдерживали в течение 30 мин, периодически перемешивая. Извлечение сливали, а процесс настаивания повторяли по описанной ранее схеме. Отдельные извлечения соединяли в фарфоровой чашке и упаривали в токе воздуха при 18-20 °С до сухого остатка.

Очистка методом адсорбционной колоночной хроматографии. Сухой остаток растворяли в 2-3 мл ацетона, смешивали полученный раствор с 1,5 г силикагеля L 40/100 мкм и после испарения растворителя вносили данную смесь в стеклянную хроматографическую колонку размером 490×1 мм, предварительно заполненную 8,5 г силикагеля L 40/100 мкм. Содержимое колонки уплотняли путем равномерного постукивания по внешней поверхности стенок. Хроматографирование осуществляли, используя в качестве элюента систему растворителей гексан-ацетон (8:2). Элюат собирали фракциями по 2 мл каждая. Фракции с 15-й по 32-ю включительно объединяли, испаряли в токе воздуха при 18-20 °С. Остаток растворяли в ацетоне, раствор количественно переносили в мерную колбу вместимостью 10 мл и доводили ацетоном до метки («Исходный ацетоновый раствор»).

Идентификация методом ТСХ. 0,01-0,25 мл исходного ацетонового раствора наносили на хроматографические пластины Сорбфил с люминесцентным индикатором в виде полосы и осуществляли хроматографирование в стеклянной камере, используя в качестве элюента систему растворителей гексан-ацетон (7:3) в присутствии вещества-свидетеля. Анализируемое вещество идентифицировали по величине Rf, в данном случае Rf=0,38.

Идентификация методом ВЭЖХ. 1 мл исходного ацетонового раствора вносили в выпарительную чашку, испаряли до сухого остатка в токе воздуха при 18-20 °С. Остаток растворяли в смеси 2,5 мл диоксана и 0,5 мл пропанола-2, к раствору добавляли 20 мл гексана, затем раствор количественно переносили в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводили смесью гексан-диоксан-пропанол-2 (40:5:1) до метки. При необходимости раствор разбавляли этой же смесью растворителей. Далее 2-16 мкл раствора вводили в хроматограф Милихром. Хроматографировали в колонке размером 64×2 мм, заполненной сорбентом силасорб-600, используя подвижную фазу гексан-диоксан-пропанол-2 (40:5:1). Скорость подачи подвижной фазы составляла 100 мкл/мин, скорость диаграммной ленты - 720 мм/ч, масштаб регистрации - 0,8 ед.о.п., время измерения - 0,6 с. Оптическую плотность измеряли при 238 нм. Анализируемое соединение идентифицировали по значению времени (объема) удерживания, совпадающему с таковым вещества-стандарта.

Идентификация и количественное определение методом УФ-спектрофотометрии. После предварительного хроматографирования методом ТСХ по указанной схеме участок хроматограммы с анализируемым веществом вырезали и элюировали вещество 5-10 мл диметилформамида. Оптическую плотность элюата измеряли на спектрофотометре СФ-2000 в кювете с толщиной рабочего слоя 10 мм при аналитической длине волны 381,8 нм.

В качестве раствора сравнения использовали элюат, полученный в контрольном опыте.

Соединение идентифицировали по форме спектральной кривой и положению максимума поглощения (381,8 нм).

Количественное содержание рассматриваемого вещества рассчитывали с помощью уравнения калибровочного графика.

Как свидетельствуют данные эксперимента (табл. 2)

Использование в качестве изолирующего агента 1,4-диоксана, предложенные условия изолирования и очистки позволяют достичь достаточно высокой степени извлечения анализируемого вещества из ткани печени трупов (87,05-88,75%). Открываемый минимум составляет 0,2 мг 4-НА в 100 г биологического материала.

Предложенная методика достаточно хорошо воспроизводима, отличается простотой выполнения, не требует сложной аппаратуры и значительных затрат времени на воспроизведение. Она может быть использована в практике при проведении экспертизы в случае отравления 4-НА.

1. Изучена возможность использования 1,4-диоксана в качестве изолирующего агента при химико-токсикологическом исследовании 4-нитроанилина.

2. Определены оптимальные условия изолирования 4-нитроанилина из биологического материала с помощью 1,4-диоксана и очистки получаемых извлечений в колонке с силикагелем L 40/100 мкм.

3. Дана количественная оценка изолирования с помощью 1,4-диоксана 4-нитроанилина из модельных смесей с тканью печени.