Распределение 4-амино-2-феноксифенилметансульфонамида в организме теплокровных животных

4-амино-2-феноксифенилметансульфонамид (далее 4-А-2-ФОФМСА) — метаболит нимесулида (4-нитро-2-феноксифенилметансульфонамида), являющегося нестероидным противовоспалительным лекарственным средством, широко применяющимся в медицинской практике. Описаны многочисленные случаи отравления нимесулидом, в том числе с летальным исходом [1, 2, 6, 8].

Изучение химико-токсикологических свойств нимесулида и его метаболитов, в частности 4-А-2-ФОФМСА, имеет важное значение.

По физическим свойствам 4-А-2-ФОФМСА — белый, возможно, со слегка сероватым оттенком кристаллический порошок без запаха, плохо растворимый в воде и гексане, растворимый в растворах кислот, этаноле, ацетонитриле и ацетоне.

Образование 4-А-2-ФОФМСА в организме теплокровных животных и человека происходит на первой ступени метаболизма нимесулида в процессе восстановления. В дальнейшем 4-А-2-ФОФМСА может ацетилироваться и превращаться в 4-ацетиламино-2-феноксифенилметансульфонамид (4-N-АА-2-ФОФМСА) [3—5, 7].

Как нимесулид, так и два его основных метаболита (4-А-2-ФОФМСА и 4-N-АА-2-ФОФМСА) могут обнаруживаться в организме теплокровных и служить доказательством отравления нимесулидом.

Значение факта обнаружения метаболитов нимесулида для доказательства отравления данным лекарственным средством возрастает с увеличением времени, прошедшего с момента попадания нимесулида в организм, и продолжительности хранения вещественных доказательств [1, 5].

Вопросы распределения метаболитов нимесулида в органах и биожидкостях теплокровных организмов до настоящего времени остаются малоизученными.

Цель исследования — изучение особенностей распределения 4-А-2-ФОФМСА в организме теплокровных животных (крысы).

Основным объектом исследования послужил 4-амино-2-феноксифенилметансульфонамид (4-А-2-ФОФМСА) с содержанием основного вещества, равным или более 99,9% (определено методом нитритометрии), а дополнительным — 4-ацетиламино-2-феноксифенилметансульфонамид (4-N-АА-2-ФОФМСА) с таким же содержанием основного вещества, определенным тем же методом.

Для изучения распределения 4-А-2-ФОФМСА 25 крысам-самцам (5 опытных групп по 5 особей в каждой) с массой тела 180—230 г через зонд вводили в желудок анализируемое вещество в количестве 1000 мг на 1 кг массы тела животного в виде водной суспензии однократно. После гибели животных трупы вскрывали; одинаковые органы и биожидкости, взятые от животных внутри каждой группы, объединяли и исследовали на наличие в них вещества 4-А-2-ФОФМСА и продукта его ацетилирования (4-N-АА-2-ФОФМСА). Параллельно исследовали органы и биожидкости животных контрольной группы (5 особей), которым вводили в желудок дистиллированную воду, не содержащую анализируемое вещество.

Изолирование. Измельченную биологическую ткань (размер частиц 3—5 мм) заливали двукратным по массе количеством ацетона, но не меньше 4 г. Смесь выдерживали 45 мин при периодическом перемешивании. Изолирующий агент сливали с твердого остатка, а процесс настаивания повторяли. Извлечения объединяли, растворитель отгоняли.

Очистка извлечений. Остаток в чашке растворяли в 3 мл ацетона, смешивали полученный раствор с 1,5 г силикагеля L 40/100 мкм и после испарения растворителя вносили данную смесь в стеклянную хроматографическую колонку размером 490×10 мм, предварительно заполненную 8,5 г силикагеля L 40/100 мкм. Содержимое колонки уплотняли, колонку оборачивали светонепроницаемой бумагой. Хроматографировали, используя подвижную фазу гексан-ацетон (6:4). Высоту столба элюента поддерживали в процессе хроматографирования на уровне 28—29 см от верхнего края столба сорбента (скорость элюирования около 0,35 мл/мин). Элюат собирали фракциями по 2 мл. В отдельных выпарительных чашках объединяли фракции с 9-й по 11-ю, которые могли содержать 4-А-2-ФОФМСА (элюат А), и с 12-й по 21-ю, которые могли содержать 4-N-АА-2-ФОФМСА (элюат Б), после чего испаряли элюент в токе воздуха при температуре 17—22 °С до получения сухих остатков. Сухой остаток в каждой чашке растворяли в 10 мл ацетона, получая раствор А и раствор Б. По 1,0—2,5 мл каждого из полученных растворов вносили в отдельные выпарительные чашки (А №1, А №2, Б №1, Б №2) и испаряли растворитель.

Идентификация методом ТСХ. Каждый из остатков в чашках А №1 и Б №1 растворяли в незначительном объеме этилацетата и количественно переносили на линию старта хроматографической пластины Сорбфил марки ПТСХ-АФ-В-УФ в виде полосы. Хроматографировали, используя элюент толуол-ацетонитрил (7:3), в присутствии веществ-свидетелей (4-А-2-ФОФМСА и 4-N-АА-2-ФОФМСА). Хроматограммы проявляли в УФ-свете. Значение Rf 4-А-2-ФОФМСА составляло 0,55±0,03, а его ацетильного производного — 0,38±0,03.

В дальнейшем каждое вещество извлекали из сорбента этанолом, идентифицировали по особенностям поглощения УФ-области спектра, а также проводили количественное определение по интенсивности поглощения в области длинноволнового максимума (для 4-А-2-ФОФМСА — 298,4 нм; для 4-N-АА-2-ФОФМСА — 287,6 нм).

Идентификация методом УФ-спектрофотометрии. Пятно того или иного анализируемого вещества вырезали из хроматограммы и элюировали 5 мл этанола в течение 15 мин. Элюат отделяли и исследовали его светопоглощение в интервале длин волн 235—350 нм, используя спектрофотометр СФ-2000, в кварцевых кюветах с длиной оптического пути 10 мм. Раствор сравнения — элюат, полученный в контрольном опыте. В случае присутствия больших концентраций анализируемого вещества элюат предварительно разбавляли этанолом. Извлечения из органов животных контрольной группы исследовали по той же схеме, что и извлечения из внутренних органов подопытных животных.

Идентификация методом ВЭЖХ. Остаток в чашках А №2 и Б №2 растворяли в 0,7 мл ацетонитрила, к полученному раствору прибавляли 1,3 мл раствора KH₂PO₄ (1,15 г/л), содержащему NH₄OH, для создания рН 7,5. При необходимости раствор разбавляли этой же смесью растворителей. Затем 20 мкл раствора вводили в хроматограф типа Shimadzu—LC-10Avp. Хроматографировали в колонке размером 250×4,6 мм (сорбент Luna-C18 5 мкм). Состав элюента: ацетонитрил — раствор KH₂PO₄ (1,15 г/л), содержащий NH₄OH, добавленный до рН 7,5, в соотношении 35:65 по объему. Скорость подачи элюента 450 мкл/мин. Температура термостата колонки 60 °С. Оптическую плотность измеряли при 230 нм. 4-А-2-ФОФМСА и 4-N-АА-2-ФОФМСА идентифицировали по характерному значению времени (объема) удерживания, совпадающими с таковыми стандарта.

Количественное определение. По величине оптической плотности элюатов в этаноле (4-А-2-ФОФМСА; λ=298,4 нм; 4-N-АА-2-ФОФМСА; λ=287,6 нм) определяли количественное содержание, используя уравнение градуировочного графика.

Для очистки 4-А-2-ФОФМСА и 4-N-АА-2-ФОФМСА методом прямофазной колоночной хроматографии от соэкстрактивных веществ биоматериала была подобрана подвижная фаза, позволяющая очистить и отделить метаболиты друг от друга в процессе хроматографирования. Первым из колонки элюировался 4-А-2-ФОФМСА (фракции 9—11), затем 4-N-АА-2-ФОФМСА (фракции 12—23).

При идентификации методом ТСХ анализируемые вещества проявляли на хроматограммах в УФ-свете. Величина Rf 4-А-2-ФОФМСА составила 0,55±0,03; 4-N-АА-2-ФОФМСА — 0,38±0,03, что соответствовало величине Rf стандартов.

В процессе идентификации методом УФ-спектрофотометрии при сравнении спектральных кривых 4-А-2-ФОФМСА и 4-N-АА-2-ФОФМСА, извлеченных из органов животных и очищенных по описанной схеме, со спектром чистого вещества в этаноле (рис. 1)

При исследовании извлечений из тканей органов крыс, не получавших 4-А-2-ФОФМСА и 4-N-АА-2-ФОФМСА, выявили отсутствие в них данных веществ. Измеренное при длине волны 298,4 и 287,6 нм фоновое поглощение элюатов из участков контрольных хроматограмм в пересчете на извлечение из 5 г одинаковых органов животных не превышало 0,140 единиц оптической плотности.

При идентификации методом ВЭЖХ время удерживания анализируемых соединений совпадало с таковым веществ-стандартов и составило 16,04 мин для 4-А-2-ФОФМСА и 15,31 мин для 4-N-АА-2-ФОФМСА. На хроматограммах анализируемых веществ не обнаружили (по сравнению с хроматограммами веществ-стандартов) дополнительных пиков и заметных смещений базовой линии (рис. 2).

Уравнения градуировочных графиков для фотометрического определения 4-А-2-ФОФМСА и 4-N-АА-2-ФОФМСА по поглощению в УФ-области спектра соответственно имели вид: А=0,0094839·С + 0,0074009 и А = 0,0108753·С + 0,0042021, где А — оптическая плотность, С — концентрация анализируемого вещества в фотометрируемом растворе (мкг/мл). Относительная ошибка среднего результата при определении 4-А-2-ФОФМСА методом фотометрии составила 0,96% (n=6; p=0,95), при определении 4-N-АА-2-ФОФМСА — 0,88% (n=6; p=0,95).

Результаты определения 4-А-2-ФОФМСА и 4-N-АА-2-ФОФМСА в органах отравленных животных представлены в табл. 1 и 2.

1. Изучили распределение 4-амино-2-феноксифенилметансульфонамида в организме теплокровных животных (крысы) при однократном введении 1000 мг/кг данного вещества в желудок.

2. В предложенных условиях введения данного отравляющего вещества наибольшее количество его присутствует в желудке с содержимым, толстой и тонкой кишке с содержимым, глазах и тимусе.

3. Помимо исходного отравляющего вещества, в организме отравленных животных, обнаруживается продукт его ацетилирования — 4-N-ацетиламино-2-феноксифенилметансульфонамид, в наибольшей степени в глазах, тонкой кишке с содержимым, селезенке и сердце.