Использование в качестве объектов молекулярно-генетического анализа отдельных клеток в принципе позволяет решать ряд проблем современной судебно-медицинской генетики, связанных с исследованием как сверхмалых количеств биологического материала, например единичных клеток, так и биологических следов, содержащих биологический материал от нескольких лиц, поскольку дает возможность выделить и анализировать индивидуальные образцы клеточного материала для каждого из компонентов смеси.

С методической точки зрения, эта привлекательная концепция имеет два аспекта: а) получение препаратов индивидуальных клеток; б) анализ ДНК индивидуальных клеток. Оба этих аспекта являются в той или иной степени проблемными. В связи с этим поиск путей анализа биологического материала, содержащегося в единичной клетке, — одна из «горячих точек» современной судебной генетики.

Высокотехнологичное решение, которое позволило получать в качестве образцов биологического материала для дальнейшего молекулярного анализа отдельные клетки, — технология LCM (от англ. Laser Сapture Microdissection — лазерная микродиссекция с последующим захватом диссектированных образцов) [1]. С момента своего появления технология лазерной микродиссекции значительно развилась и усовершенствовалась, нашла применение в области судебной генетической экспертизы для решения некоторых частных задач [2—6]. Тем не менее по-прежнему проблемой остается типирование ДНК в препаратах единичных клеток, полученных с помощью LCM, которые неизбежно содержат крайне малое количество генетического материала.

Ранее членами нашего авторского коллектива был опубликован ряд работ [7—12], посвященных этой проблеме. В них технология LCM получила развитие именно в применении к судебно-экспертному генотипированию ДНК в препаратах единичных клеток.

В ходе этих исследований были установлены объективные ограничения на генотипирование STR-локусов хромосомной ДНК (хрДНК) в единичных клетках человека. В частности, показано, что достоверные результаты типирования с использованием стандартных мультиплексных систем могут быть получены при одновременном анализе не менее чем 10 диплоидных клеток. Количественный порог, определенный нами для получения стабильных воспроизводимых результатов, составляет 15—20 клеток [11]. Это означает, что для одной отдельной клетки человека генотипирование хромосомных STR-маркеров в его нынешнем типовом методическом варианте (имеется в виду прямое генотипирование STR-локусов хрДНК с использованием мультиплексных ПЦР-систем) объективно недостижимо.

Тем не менее теоретически, в плане преодоления данного ограничения, могут быть реализованы другие варианты генотипирования STR-локусов хрДНК.

В настоящей работе проведена оценка эффективности некоторых специальных методических приемов, а именно: использование мультилокусных ПЦР-систем низкой плексности и технологии MDA (англ. Multiple Displacement Amplification) [13, 14] амплификации генома WGA (Whole-Genome Amplification) [15, 16] применительно к решению задачи анализа полиморфных STR-локусов хрДНК в одной отдельной клетке.

В целях максимальной информативности мы отказались от использования имитационной модели (эквивалентные разведения ДНК); работу выполняли на реальных препаратах, полученных путем диссектирования и объединения необходимого числа клеток.

Объектом исследования служили клетки буккального эпителия человека (свежие мазки со слизистой оболочки ротовой полости).

Проводили диссекцию неокрашенного клеточного материала с помощью микродиссектора Carl Zeiss PALM CombiSystem («Carl Zeiss», Германия). Для приготовления образцов использовали полиэтиленнафталеновые PEN membrane slides («Carl Zeiss», Германия), для обзорно-поисковых целей — объектив LD Plan-Neofluar 20x/0.50 Ph 2, а во время процесса микродиссекции — объектив LD Plan-Neofluar 40x/0.60 Korr.

Полногеномную преамплификацию генетического материала диссектированных клеток в варианте WGA-MDA проводили с помощью набора QIAGEN REPLI-g MiniKit (QIAGEN, Германия). Предлагаемый производителем протокол WGA был адаптирован для малых объемов (до 5 мкл) исходного препарата и последующего проведения всех стадий ПЦР-анализа в одной пробирке. После стадии WGA полученный обогащенный препарат амплифицировали, используя мультиплексные STR-панели AmpFlSTR Minifiler PCR Amplification Kit («Applied Biosystems», США) и Investigator Triplex AFS QS Kit (QIAGEN, Германия). Для анализа матричной активности ДНК человека пользовались системой количественной энзиматической амплификации Quantifiler Duo DNA Quantification Kit («Applied Biosystems», США).

Все аналитические процедуры проводили, руководствуясь инструкциями фирм-производителей, или как описано в ранее опубликованных нами работах [7—11].

Реализация идеи генотипирования полиморфных STR-локусов хрДНК в единичных клетках человека предполагает решение двух основных методических задач. Во-первых, получение препаратов индивидуальных клеток; во-вторых, анализ ДНК, полученной из этих индивидуальных клеток.

С некоторыми оговорками [10, 12] можно отметить, что с развитием технологии LCM первая задача оказалась в какой-то мере решена. Вторая задача, в частности типирование ДНК в полученных с помощью LCM препаратах единичных клеток, которые содержат крайне малое количество генетического материала, пока не очень поддается решению.

Теоретически, методом анализа очень малого количества ДНК, такого, например, какое содержится в единичной клетке, может выступать вариант монолокусной системы ПЦР-типирования. Ее преимуществом перед мультилокусными мультиплексными панелями является более высокая стабильность и главное — возможность применения многораундового протокола (реамплификации), многократно повышающей чувствительность системы без снижения качества результата.

В свое время нами был разработан методический подход, основанный на использовании LCM в сочетании с именно таким монолокусным многораундовым типированием для анализа в диссектированных клетках митохондриальной ДНК (мтДНК). Результатом этой работы явилось создание методики судебно-экспертного молекулярно-генетического исследования сверхмалых количеств биологического материала вплоть до одной отдельной клетки [7—9].

Недостатком системы типирования, основанной только на полиморфизме последовательности мтДНК, является ее относительно невысокий дискриминирующий потенциал. Поэтому мы оценили [11] перспективы и возможности технологии LCM также для целей экспертного анализа хрДНК.

В случае генотипирования хрДНК монолокусные системы поодиночке также не обладают дискриминирующим потенциалом, достаточным для получения доказательного результата, а постановка необходимого числа последовательных тестов в случае типирования ДНК в единичной клетке невозможна. На практике для целей типирования хрДНК в единичной клетке представляют интерес только мультиплексные системы, которые в настоящее время являются своего рода стандартом для судебно-экспертного типирования STR-локусов хрДНК.

Основная проблема, препятствующая успешному генотипированию хрДНК в одной изолированной клетке, — неустойчивость результатов, получаемых с применением мультиплексных ПЦР-панелей, в препаратах, содержащих крайне малое количество исходного генетического материала [17].

В определенном смысле такую неустойчивость можно интерпретировать как недостаточную чувствительность амплификационной системы.

Одним из способов повышения чувствительности ПЦР-систем является увеличение количества циклов амплификации. К сожалению, этот наиболее очевидный путь снижения порога исходного количества ДНК-матрицы не решает проблему, так как часто приводит к увеличению количества как специфического, так и неспецифического продукта (в результате амплификации минорных примесных компонентов и продуктов неспецифической посадки праймеров). Другой нежелательный эффект увеличения количества циклов полимеразной реакции — снижение общей стабильности мультиплексных систем. Это проявляется в виде таких артефактов амплификации, как спорадические выпадения истинных аллелей и появление ложных.

Именно такой результат получен нами в экспериментах с мультиплексной STR-панелью AmpFlSTR Minifiler PCR Amplification Kit с расчетным дискриминирующим потенциалом 99,9999999994%, с использованием которой для 10 диплоидных клеток может быть получен полный 8-локусный профиль человека (рис. 1, а, на цв. вклейке

В стандартной постановке (проведение рекомендованных производителем 30 циклов полимеразной реакции) снижение количества исходного клеточного материала приводит к нарастающему появлению ложных результатов типирования и в пределе, при переходе к анализу единичной клетки, к практически полному отсутствию продуктов амплификации. Увеличение количества циклов, в наших экспериментах до 34, хотя и позволяет несколько повысить общую чувствительность системы, тем не менее способствует увеличению ее нестабильности. Регистрируется низкий уровень артефактной матричной активности ДНК, сопровождающийся появлением неспецифических продуктов амплификации (см. рис. 1, б, на цв. вклейке).

Решением этой проблемы, по нашему мнению, могло бы стать использование панелей с возможно меньшей плексностью, т.е. с меньшим количеством одновременно амплифицируемых матриц. Это теоретически должно способствовать повышению общей стабильности ПЦР-системы и повышению уровня воспроизводимости получаемых результатов.

В качестве такой ПЦР-системы мы выбрали панель Investigator Triplex AFS QS Kit, которая позволяет осуществлять одновременную амплификацию трех фрагментов хрДНК. Дискриминирующий потенциал этого триплекса меньше, чем у 9-локусной панели Minifiler, однако смысл его применения в том, что данная ПЦР-система изначально оптимизирована производителем на 34 цикла амплификации с гарантированным сохранением устойчивости системы.

Как показали проведенные нами эксперименты, триплекс успешно себя проявил на уровне 10 клеток, продемонстрировав существенно более высокий по сравнению с 9-локусной панелью Minifiler уровень сигнала (см. рис. 1, а и рис. 2, а, на цв. вклейке).

В качестве радикального подхода к увеличению количества геномной ДНК, исходно содержащейся в одной клетке, до уровня, достаточного для генотипирования, использовали методику амплификации полного генома WGA (Whole-Genome Amplification) [15, 16].

WGA в различных ее модификациях предполагает множественное копирование всех присутствующих в препарате ДНК-матриц и последующий анализ обогащенного препарата с помощью обычных ПЦР-систем. В качестве технологического варианта использовали MDA (Multiple Displacement Amplification) — методику амплификации путем множественного вытеснения полинуклеотидных цепей [14].

Полученное при полногеномной амплификации множество копий исходной ДНК создает теоретическую возможность для анализа любого интересующего локуса. Тем не менее, несмотря на потенциальную возможность анализа сверхмалых количеств генетического материала, которую дает использование WGA, вопрос о реальной практической применимости данного метода остается открытым, главным образом из-за сомнений в способности высокопроцессивной ДНК-полимеразы φ29 обеспечить равнопропорциональную представленность нуклеотидных последовательностей в исходной геномной ДНК и в продуктах полимеразной реакции.

Ранее мы уже изучали этот аспект использования технологии WGA-MDA для повышения чувствительности базовых методов судебно-генетического экспертного типирования хрДНК [18]. Результаты были положительными. Достигнуто значительное, в 5—10 раз, увеличение количества ДНК, содержавшейся в исходном препарате, без утраты ее индивидуальной специфичности. Следует оговориться, что эти результаты получены для монолокусных систем генотипирования и для бóльших количеств стартовой ДНК.

В настоящей работе типирование ДНК в препаратах единичных диссектированных клеток, прошедших процедуру WGA-MDA, проводили с использованием ранее упоминавшихся мультиплексных STR-панелей: 9-локусной Minifiler и минимальной 3-локусной Triplex AFS QS. Результаты представлены на рис. 1, в и рис. 2, в (на цв. вклейке) соответственно.

Для обоих тест-систем, несмотря на общее заметное увеличение амплитуды сигнала, полученные амплификационные профили не соответствуют истинным. Наблюдается типичный спектр стохастических артефактов: нарушение баланса сигнала гетерозиготных аллелей, снижение амплитуды сигнала или полное выпадение отдельных аллельных вариантов (drop-out), появление неспецифических ложных продуктов амплификации (drop-in).

Этот отрицательный результат имеет принципиальное значение и потому требует подробного рассмотрения.

На рис. 3 (см. на цв. вклейке)

В ходе полногеномной амплификации (WGA-MDA) количество исходной ДНК в анализируемых препаратах возросло многократно, хотя и в разной степени в зависимости от стартового количества. При очень низком содержании ДНК (препарат одной клетки) фактор увеличения составил порядка 30, тогда как для большей концентрации (100 клеток) всего 4—5 (примечательно, что этот последний результат в точности повторяет результаты нашей более ранней работы [18]).

Важно, что количество доступной для анализа матричной ДНК в амплифицированном препарате одной клетки (~170 пг) можно считать вполне достаточным для достоверного генотипирования STR-локусов хрДНК с применением использованных в работе мультиплексных панелей (заявленный производителем минимум составляет 125 пг) [19].

Из этого следует, что в нашем эксперименте в подтверждение неоднократно высказывавшимся опасениям (см. ранее) эффективность наработки в ходе реакции WGA-MDA разных фрагментов генома (в том числе разных STR-локусов) оказалась различной. Именно в этом причина искажения амплификационного профиля.

Таким образом, следует признать, что по состоянию на сегодняшний день мультилокусное генотипирование полиморфных STR-локусов хрДНК в единичных клетках человека остается за пределами возможного. Ни использование мультилокусных ПЦР-систем низкой плексности, ни технология полногеномной амплификации не позволяют решить задачу достоверного мультилокусного генотипирования хрДНК в одной отдельной клетке.

В заключение хотелось бы отметить, что в имеющейся по данной проблематике литературе с трудом, но можно найти весьма ограниченное число работ, авторы которых заявляют об успешном генотипировании хрДНК в одной- единственной клетке. Такое противоречие с результатами настоящей работы на самом деле кажущееся и имеет несколько объяснений. Во-первых, в этих работах могут рассматриваться иные варианты генотипирования, которые не являются предметом настоящей статьи. Подчеркиваем, что данная работа конкретно о трудностях мультилокусного генотипирования STR-локусов хрДНК. Во-вторых, многие такие работы сделаны на имитационных моделях — с использованием не клеточных препаратов, а эквивалентных разведений ДНК. Мы отказались от этого пути, как не обеспечивающего достаточную объективность результатов. В-третьих, многие из результатов, представленных в этих работах, можно рассматривать только как демонстрационные; на самом деле они не удовлетворяют стандартам судебно-экспертного исследования. В качестве примера сошлемся на известную работу K. Hanson и J. Ballantyne [20], в которой приведены результаты успешного мультилокусного типирования препаратов, содержащих 5 пг геномной ДНК (количественный эквивалент одного клеточного генома), но полученный STR-профиль, с экспертной точки зрения, никак нельзя признать достоверным.

В этом контексте в качестве рабочего варианта генотипирования хрДНК в одной отдельной клетке нам представляется целесообразным вернуться к модели монолокусного типирования с применением двухраундовой ПЦР на матрице какого-нибудь высокополиморфного STR-локуса. В качестве примера можно предложить самый полиморфный из ныне известных — локус SE33, дифференцирующий потенциал которого составляет 99,49%.

Такие исследования нами проводятся. Результаты будут опубликованы отдельно.

Работа выполнена с использованием оборудования Центра коллективного пользования ФГБУН «Институт молекулярной генетики» Российской академии наук «Центр клеточных и генных технологий».