Ногтевые пластины являются придатком кожи. Они образованы плотно прилегающими друг к другу роговыми чешуйками, заполненными белком кератином. Ногтевые пластины и их срезы содержат достаточное количество генетического материала и более устойчивы к разложению, чем мягкие ткани. С учетом этого ногтевые пластины используют как объект судебно-медицинской экспертизы при идентификации неопознанных лиц, а фрагменты ногтей могут быть исследованы в качестве биологического следа предполагаемого преступника при проведении судебно-медицинской экспертизы вещественных доказательств [1—3]. Первоначально для выделения ДНК из ногтей использовали метод фенолхлороформной экстракции с последующей очисткой и концентрированием препарата ДНК [1]. Это многостадийный, трудоемкий и длительный процесс, связанный с использованием токсичных реагентов и сопровождающийся большими потерями ДНК [4]. В настоящее время разработаны более эффективные и удобные способы выделения ДНК, позволяющие в большинстве случаев отказаться от фенольного метода.

Цель исследования — изучение возможности применения коммерческих наборов для выделения ДНК при анализе срезов ногтевых пластин, а также их сравнение с целью выявления оптимального подхода при исследовании малых количеств ногтей в рамках молекулярно-генетических экспертиз.

Испытаны три набора реагентов, действие которых основано на способности молекул ДНК селективно сорбироваться на различных носителях, а при изменении условий переходить обратно в раствор: 1) набор PrepFiler BTA Forensic DNA Extraction Kits (фирма «Applied Biosystems Life Technologies», США); 2) комплекс наборов Tissue and Hair Extraction Kit и DNA IQ System (фирма «Promеga Corporation», США); 3) набор QIAamp DNA Investigator Kit (фирма «Qiagen Group», Германия).

При использовании первых двух наборов ДНК сорбируют на магнитных частицах, а ¹/₃ его — на мембране колонок.

Реагенты фирм «Promеga Corporation» и «Applied Biosystems Life Technologies» предназначены для выделения ДНК из тканей, волос и костей, а набор фирмы «Qiagen Group» разработан для получения препаратов ДНК из различного биоматериала, в том числе ногтей.

1. Фрагменты ногтевых пластин длиной от 2 до 10 мм от 33 лиц мужского и женского пола. Навески подготовленного материала составляли от 0,9 до 15,6 мг.

2. Ногтевая пластина трупа, мягкие ткани которого находились в значительной степени разложения.

Срезы ногтевых пластин очищали скальпелем от загрязнений, в том числе от подногтевого содержимого, затем отмывали последовательно в деионизированной воде и 96% этиловом спирте и сушили на воздухе. Для выделения по протоколам №1 и №2 (см. Выделение ДНК) ногти тщательно измельчали скальпелем путем послойного расщепления на тонкие фрагменты. Для выделения по протоколу №3 ногти нарезали на фрагменты с помощью ножниц.

Протокол №1. Выделение ДНК с использованием набора реагентов PrepFiler BTA Forensic DNA Extraction Kits.

Для полноты лизирования образцов в буфер ВТА Prep Filer через 4 и 14 ч после начала инкубации вносили дополнительно 7 мкл протеиназы К (20 мг/мл) и 3 мкл 1М дитиотреитола (DTT). В остальном процесс выделения ДНК соответствовал инструкции фирмы-производителя. Объем элюирующего буфера составлял 50 мкл.

Протокол №2. Выделение ДНК с использованием комплекса реагентов Tissue and Hair Extraction Kit и DNA IQ System.

Модификация инструкции к набору Tissue and Hair Extraction Kit состояла в следующем: время инкубации при температуре 56 °С увеличили до 18 ч, а через 14 ч после начала инкубации добавляли повторно 10 мкл протеиназы К (18 мг/мл) и 10 мкл 1М DTT. Объем элюирующего буфера составлял 50 мкл.

Протокол №3. Методику фирмы-производителя для выделения ДНК из волос и ногтей к набору QIAamp DNA Investigator Kit применяли без изменений. Объем элюирующего буфера составлял 50 мкл.

Качественную и количественную оценку препаратов ДНК проводили методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени на приборе АНК-32 (ИАП РАН, Санкт-Петербург) с использованием тест-системы аХY-детект (ЗАО «Синтол», Москва), которая разработана на основе варианта набора ХY-детект [5].

STR-типирование. Проводили ПЦР с использованием наборов реагентов AmpFlSTR Identifiler PCR Amplification Kit, AmpFlSTR Identifiler Plus PCR Amplification Kit, AmpFlSTR Yfiler PCR Amplification Kit на амплификаторах GeneAmp 9700 Gold (фирма «Applied Biosystems Life Technologies», США). Электрофоретическое разделение осуществляли на генетическом анализаторе 3130xl (фирма «Applied Biosystems Life Technologies», США) в среде полимера РОР-4, используя программу Foundation Data Collection v. 3.0. Обработка результатов и идентификация аллелей производились автоматически с помощью программы Gene Mapper v. 3.2 с последующей проверкой экспертами.

В ходе выполнения экспертных исследований в Институте криминалистики в течение ряда лет проводили анализ ДНК, выделенной из фрагментов и срезов ногтей. ДНК выделяли различными способами: сначала методом фенолхлороформной экстракции, затем с использованием указанных ранее наборов для выделения ДНК.

Результаты количественной оценки препаратов показали, что при использовании протокола №2 значение концентрации ДНК в среднем не превышает 1 нг/мкл, тогда как в препаратах, полученных по протоколам №1 и №3, содержание ДНК, как правило, выше. Соответственно была предпринята попытка подобрать такие коммерческие наборы для выделения ДНК, которые позволяли бы выделять максимальное количество ДНК при исследовании микрофрагментов ногтей. Для этого сравнили содержание выделенной ДНК в препаратах, полученных из предварительно взвешенных образцов ногтей 32 лиц.

Навески образцов ногтей составляли от 0,9  до 15,6 мг. Количество выделенной ДНК:

— протокол №1 — от 0,57 до 20,15 нг/мкл;

— протокол №2 — от 0,03 до 2,36 нг/мкл;

— протокол №3 — от 0,23 до 41 нг/мкл.

На рис. 1

Оказалось, что при одном и том же количестве исходного материала по протоколам №1 и №3 выделено больше ДНК, чем по протоколу №2, причем разница составила до 20 раз.

Срезы ногтей являются материалом, в котором возможна значительная деградация ДНК. Кроме того, количество ядерных структур в них может колебаться у различных индивидуумов. Для сравнения эффективности выделения различными способами была проведена экстракция ДНК из разных навесок фрагментов ногтей, отобранных от одного лица.

Решали определенную задачу: определить диапазон масс навесок материала. При исследовании большого количества навесок ногтевых пластин (около 1 г), вероятно, не возникнет проблемы выделить ДНК в количестве, достаточном для последующего генотипирования. В экспертной практике наибольшую сложность представляют микрообъекты, поэтому основное внимание уделили малым навескам: 1, 2, 3, 5, 7 мг (рис. 2).

При использовании протоколов №1 и №3 из всех навесок было экстрагировано количество ДНК, достаточное для проведения генотипирования (от 0,04 до 1,28 нг/мкл). В растворах, полученных по протоколу №2, ДНК человека не обнаружили. Такие результаты эксперимента, на наш взгляд, можно объяснить низким содержанием ДНК в ногтевых пластинах конкретного донора, что привело к выделению относительно небольшого количества ДНК из всех исследованных навесок.

С учетом предыдущих результатов использование реагентов фирмы «Promega Corporation» следует считать ограниченно пригодным для выделения ДНК из ногтей.

Сходные результаты получены при выделении ДНК из ногтевой пластины трупа тремя указанными способами. На исследование был представлен фрагмент гнилостно измененного пальца, мягкие ткани которого были непригодны для генетического исследования, а костный фрагмент фаланги пальца очень мал. Результаты количественной оценки препаратов ДНК показаны в таблице.

Эффективность выделения ДНК во всех случаях подтверждалась последующим генотипированием. Полученные генетические профили оценивали по сбалансированности наработки амплифицируемых фрагментов. Соотношения высот пиков флюоресценции на электрофореграммах составляли не менее 0,8 для гетерозигот и от 1,4 до 3,5 для коротких и длинных локусов.

Таким образом, для выделения ДНК из ногтевых пластин можно использовать модифицированные протоколы к наборам PrepFiler BTA Forensic DNA Extraction Kits и Tissue and Hair Extraction Kit. Эффективность выделения ДНК при использовании реагентов фирмы «Promega Corporation» оказалась ниже, чем у двух других фирм-производителей. При использовании протокола №2 для получения достаточного для генотипирования количества ДНК необходимо не менее 1,5 мг исходного материала, в то время как реагенты фирм «Applied Biosystems Life Technologies» и «Qiagen Group» можно применять при навеске образца ногтевой пластины массой 0,9 мг.

Сравнение результатов, полученных при использовании наборов PrepFiler BTA Forensic DNA Extraction Kits и QIAamp DNA Investigator Kit, не выявило значимых отличий в эффективности выделения ДНК. Работа с набором фирмы «Qiagen Group» не предполагает тщательного измельчения ногтевой пластины, что облегчает пробоподготовку, однако стоимость выделения из одного образца оказывается в 1,5—2 раза выше, чем при выделении с помощью набора фирмы «Applied Biosystems Life Technologies».

Таким образом, при наличии достаточно большого количества материала (более 5 мг) можно использовать любой из трех наборов. В то же время при работе с микроколичествами ногтей предпочтительнее применять набор PrepFiler BTA Forensic DNA Extraction Kits или QIAamp DNA Investigator Kit.

В целом использование коммерческих наборов для выделения ДНК позволяет отказаться от метода фенолхлороформной экстракции при молекулярно-генетическом исследовании фрагментов ногтевых пластинок. Время выделения ДНК не превышает 20 ч, а исходная навеска биоматериала в количестве 1—3 мг позволяет получить высокоочищенный препарат ДНК. Количество выделенной ДНК достаточно не только для генотипирования по локусам STR, но и для проведения дополнительных генетических исследований.