4-Нитроанилин (в дальнейшем — 4-НА) находит широкое применение как химическое промежуточное звено в синтезе антиоксидантов, красителей, пигментов, ингибиторов бензиновых смол и фармацевтических препаратов (например, нимесулида, нитразепама, флунитразепама).

4-НА — это желтые моноклинные игольчатые кристаллы или ярко-желтый порошок. Температура плавления — 146 °C. Растворим в горячей или кипящей воде, хорошо растворим в этаноле, ацетоне, хлороформе, диметилформамиде, плохо — в гексане [1, 2].

4-НА токсичен в отношении теплокровных животных и человека (LD₁₀₀ ≥600 мг/кг для крыс при внутрибрюшинном введении). В концентрации 10 мг/м³ при ингаляционной экспозиции в течение 4 ч он способен вызвать первые признаки метгемоглобинемии у крыс [3, 4]. Имеются сведения об отравлениях 4-НА людей, в том числе и с летальным исходом [2].

Токсические свойства 4-НА, его широкое применение и наличие случаев отравления человека обусловливают интерес к нему как к потенциальному объекту судебно-химического исследования [4, 5].

До настоящего времени остается недостаточно изученным распределение данного соединения в организме теплокровных животных [1, 2].

Цель данного исследования — изучение особенностей распределения 4-НА в организме теплокровных животных (крысы).

Объектом исследования явился 4-НА (РСО с содержанием основного вещества, определенного методом газовой хроматографии, не менее 99,0%).

В ходе исследования 25 крысам-самцам (5 опытных групп по 5 особей в каждой) массой 175—210 г через зонд однократно вводили в желудок 4-НА (800 мг на 1 кг массы животного) в виде водной суспензии. После гибели животных трупы вскрывали, одинаковые органы и биожидкости, взятые от животных каждой из групп, объединяли и исследовали на наличие в них 4-НА. Параллельно исследовали органы и биожидкости животных контрольной группы (5 особей), которым вводили в желудок дистиллированную воду, не содержащую анализируемое вещество.

Изолирование. Мелкоизмельченную биологическую ткань заливали двукратным по массе количеством диоксана, но не меньшим, чем 4 мл. Смесь выдерживали 45 мин при периодическом перемешивании. Изолирующий агент сливали с твердого остатка, а процесс настаивания повторяли. Извлечения объединяли в выпарительной чашке, растворитель испаряли.

Очистка извлечений. Остаток, полученный после испарения диоксана из объединенного извлечения, растворяли в 3 мл ацетона, смешивали полученный раствор с 1,5 г силикагеля L 40/100 мкм и после испарения растворителя вносили данную смесь в стеклянную хроматографическую колонку размером 120×10 мм, предварительно заполненную 8,5 г силикагеля L 40/100 мкм. Содержимое колонки уплотняли путем равномерного постукивания по внешней поверхности ее стенок. Хроматографировали, используя подвижную фазу тетрахлорметан—ацетон (9:1). Высоту столба элюента поддерживали в процессе хроматографирования на уровне 28—29 см от верхнего края столба сорбента (скорость элюирования около 0,57 мл/мин). Элюат собирали фракциями по 2 мл. Фракции с 14-й по 21-ю включительно объединяли, испаряли в токе воздуха при температуре 20—22 °С. Остаток растворяли в 10 мл ацетона. По 1,0—2,5 мл полученного раствора вносили в три выпарительные чашки (№1, 2, 3) и испаряли растворитель.

Идентификация методом ТСХ. Остаток в чашке №1 растворяли в незначительном объеме хлороформа и количественно переносили на линию старта хроматографической пластины Сорбфил марки ПТСХ-АФ-В-УФ в виде полосы. Хроматографировали, используя элюент гексан—ацетон (7:3) в присутствии вещества-свидетеля. Хроматограммы проявляли в УФ-свете. 4-НА идентифицировали по величине R_f=0,38.

В дальнейшем анализируемое вещество извлекали (элюировали) из сорбента ДМФА, идентифицировали по спектрам в УФ- и видимой области, а также проводили количественное определение по интенсивности поглощения в области длинноволнового максимума (381,8 нм).

Идентификация методом УФ-спектрофотометрии. Пятно анализируемого вещества вырезали из хроматограммы и элюировали 5 мл ДМФА в течение 15 мин. Элюат отделяли и исследовали его светопоглощение в интервале длин волн 250—500 нм, используя спектрофотометр СФ-2000, в кварцевых кюветах с длиной оптического пути 10 мм. Раствор сравнения — элюат, полученный в контрольном опыте. В случае присутствия больших концентраций анализируемого вещества элюат предварительно разбавляли ДМФА. Извлечения из органов животных контрольной группы исследовали по той же схеме, что и извлечения из внутренних органов отравленных животных.

Идентификация методом ВЭЖХ. Остаток в чашке №2 растворяли в смеси 0,5 мл диоксана и 0,1 мл пропанола-2, к раствору прибавляли 4 мл гексана и 0,4 мл смеси гексан—диоксан—пропанол-2 (40:5:1). При необходимости раствор разбавляли этой же смесью растворителей. 2—16 мкл раствора вводили в хроматограф типа Милихром. Хроматографировали в колонке размером 64×2 мм (сорбент Силасорб-600), используя элюент гексан—диоксан—пропанол-2 (15:5:1).Скорость элюента 100 мкл/мин, скорость диаграммной ленты 720 мм/ч, масштаб регистрации 0,8 ед.опт. пл., время измерения 0,6 с. Оптическую плотность измеряли при 238 нм. Исследуемое вещество идентифицировали по характерному значению времени (объема) удерживания, совпадающему с таковым стандарта.

Идентификация методом хромато-масс-спектрометрии. Остаток в чашке №3 растворяли в 2 мл хлорида метилена. 4 мкл полученного раствора вводили в хроматограф фирмы «Agilent Technologies» (США) модели 6850 Network GC System с масс-селективным детектором модели 5973 Network. Пробу вводили c делением потока 1:2. Условия анализа: колонка — кварцевая капиллярная

DB-5 MS EVIDEX (25 м × 0,2 мм × 0,33 мкм); температура инжектора 250 °С, интерфейса детектора — 300 °С; начальная температура термостата колонки 70 °С поддерживалась в течение 3 мин, затем нагревали до 290 °С (20 °С/мин); газ-носитель — гелий, скорость газа-носителя 0,6 мл/мин. Масс-селективный детектор работал в режиме электронного удара (70 эВ). Сигнал регистрировали по полному ионному току с задержкой на растворитель в 3,5 мин. Диапазон сканирования 40—500 m/z. Вещество идентифицировали по совпадению масс-спектра с библиотечным на 86% и более. Также при идентификации учитывали характерное время удерживания.

Количественное определение. По величине оптической плотности элюата в ДМФА (λ=381,8 нм) определяли количественное содержание 4-НА, используя уравнение градуировочного графика.

При идентификации методом ТСХ анализируемое вещество проявляли на хроматограммах в УФ-свете (темное пятно на более светлом общем фоне пластины). Величина R_f его составляла 0,38±0,03, что соответствовало величине R_f стандарта 4-НА.

В процессе идентификации методом УФ-спектрофотометрии при сравнении спектральных кривых 4-НА, извлеченного из органов животных и очищенного по описанной выше схеме, со спектром чистого вещества в ДМФА обнаруживалось совпадение формы спектральной кривой и положения точек экстремумов (в области 381,8 и 282,3 нм) (рис. 1).

При исследовании извлечений из тканей органов крыс, не получавших 4-НА, установлено отсутствие в них данного вещества. Измеренное при 381,8 нм фоновое поглощение элюатов из участков контрольных хроматограмм в пересчете на извлечение из 5 г одинаковых органов животных не превышало 0,008 ед. опт. пл.

При идентификации методом ВЭЖХ время удерживания анализируемого соединения совпадало с таковым вещества-стандарта и составляло 11,30 мин. На хроматограммах анализируемого вещества не обнаруживалось (по сравнению с хроматограммами вещества-стандарта) присутствия дополнительных пиков и заметного смещения базовой линии.

При идентификации методом хромато-масс-спектрометрии время удерживания 4-НА совпадало с временем удерживания стандарта (11,40 мин; рис. 2, 3).

На масс-спектрах присутствовали характерные осколки для молекулы 4-НА с m/z 65, 108 и 138 (см. рис. 2, 3).

Уравнение градуировочного графика для фотометрического определения 4-НА по поглощению в УФ-области спектра имело вид: А = 0,17552·С – 0,003189, где А — оптическая плотность, С — концентрация анализируемого вещества в фотометрируемом растворе, мкг/мл.

Относительная ошибка среднего результата при определении 4-НА методом УФ-спектрофотометрии не превышала 1,038% (n=6; p=0,95).

Результаты определения 4-НА в органах отравленных животных представлены в таблице.

1. Изучено распределение 4-нитроанилина в организме теплокровных животных (крысы) при однократном введении 800 мг/кг отравляющего вещества в желудок.

2. Установлено, что в предлагаемых условиях введения отравляющего вещества наибольшие его количества присутствуют в желудке с содержимым, почках и легких отравленных животных.