В последние десятилетия метод газовой хроматографии с масс-селективным детектором (GC/MS) занимал ведущее место при проведении судебно-химических исследований наркотических средств в биологическом материале. Затруднения возникали лишь при определении высокополярных и термолабильных соединений. В последние годы лучшей альтернативой методу GC/MS стало применение жидкостной хроматографии с масс-селективным детектором (LC/MS), которая соответствует всем требованиям, предъявляемым к методам судебной и токсикологической химии. Распространение в практических лабораториях современных LC/MS-систем ограничивает их высокая стоимость. Наиболее доступными на сегодняшний день являются приборы с одноквадрупольными масс-селективными детекторами (QS). При сравнительно меньшей стоимости они обладают высокой чувствительностью, специфичностью, имеют широкий линейный диапазон. Разработчики приборов данного класса позиционируют QS как приборы для рутинного анализа [1].
Цель данной работы — изучение возможности применения QS для определения морфина и кодеина в судебно-химической практике.
Обзор доступной литературы показал, что методом LC/MS морфин и кодеин чаще всего определяют в биологических жидкостях, реже — в биотканях [2, 3].
Основной задачей данной работы стало определение наркотических веществ в крови, моче, печени и других органах с применением высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), сопряженной с QS. В качестве источника ионизации использовали электрораспыление (ESI), что обусловлено физико-химическими свойствами исследуемых веществ и чаще всего описывается в литературе [4]. Разделение проводили на обращенно-фазовых сорбентах С-18, в качестве подвижной фазы применяли муравьиную кислоту и ацетонитрил.
Предварительно были исследованы режимы работы детектора, позволяющие получить высокий отклик на исследуемые вещества при наилучшем соотношении сигнал/шум. Были разработаны 2 режима работы детектора по выбранным ионам (SIM-метод):
— режим SIM-1 использовали для идентификации исследуемых веществ. С помощью изменения напряжения на фрагментаторе (150 В) проводили частичную диссоциацию молекулярного иона с образованием 5—6 дополнительных дочерних ионов: для морфина – m/z 153, 181, 227, 229, 286, 287 (рис. 1),
— режим SIM-2 применяли для количественного определения морфина (кодеина). При ионизации образовывался только молекулярный ион морфина (кодеина), по которому проводили количественное определение, что значительно увеличило чувствительность методики. Напряжение на фрагментаторе составляло 220 В.
Представленный алгоритм идентификации и количественного определения позволил компенсировать отсутствие системы тандемной масс-спектрометрии, значительно увеличить отношение сигнал/шум для исследуемых веществ, снизить фон соэкстрактивных примесей.
На этапе пробоподготовки для получения чистых извлечений применяли двойную очистку кислого гидролизата: амиловым спиртом для удаления пигментов и диэтиловым эфиром для удаления веществ кислого характера. Перед хроматографированием применяли микроэкстракцию, что также значительно снизило количество соэкстрактивных веществ.
Представленный подход позволил снизить предел детектирования морфина и кодеина в биологическом материале до уровня терапевтических концентраций, улучшить идентификацию веществ и получить воспроизводимые результаты.
Результаты исследования иллюстрируют хроматограммы экстрактов крови, содержащей 0,014 мг% морфина и 0,002 мг% кодеина (рис. 3),
Как видно на рис. 3, 4, небольшие концентрации исследуемых веществ хорошо идентифицируются, фон соэкстрактивных веществ не оказывает значительного влияния на хроматографические профили пиков. Масс-спектрограммы морфина и кодеина практически совпадают с библиотечными масс-спектрами, что позволяет надежно идентифицировать аналиты в концентрациях от 0,002 мг%. Такие результаты хорошо согласуются с данными литературы [5].
На основании проведенных исследований была разработана следующая методика качественного и количественного определения морфина и кодеина в биологическом материале. Подготовку проб осуществляли согласно процедуре, описанной в работе [3].
Гидролиз печени. К 6 г мелкоизмельченной печени (средняя проба из 30 г) добавляли 10 мл 18% раствора соляной кислоты, гидролизовали в течение 60 мин в термостате в герметично закрытом флаконе вместимостью 16 мл при температуре 120 °С. Гидролизат охлаждали, фильтровали. Остаток органов и фильтр промывали 18% раствором соляной кислоты до 10 мл общего объема гидролизата.
Гидролиз крови. К 3 мл крови добавляли 1 мл 6% раствора трихлоруксусной кислоты, 2 мл 18% раствора соляной кислоты и гидролизовали в герметично закрытом флаконе вместимостью 16 мл в течение 60 мин в термостате при температуре 120 °С. Гидролизат охлаждали, центрифугировали, фильтровали, фильтр промывали 18% раствором соляной кислоты до 6 мл общего объема гидролизата.
Гидролиз мочи. К 4 мл мочи добавляли 2 мл концентрированной соляной кислоты и гидролизовали в герметично закрытом флаконе вместимостью 16 мл в течение 60 мин в термостате при температуре 120 °С. Охлажденный гидролизат фильтровали через бумажный фильтр, фильтр промывали 18% раствором соляной кислоты до 6 мл общего объема гидролизата.
К фильтрату гидролизатов раздельно добавлялипо 0,2 мл раствора налтрексона с концентрацией 0,015 мкг/мл (для крови и мочи) и 0,2 мл раствора налтрексона с концентрацией 0,15 мкг/мл для печени, оставляли на 15 мин. Затем экстрагировали в течение 3 мин 2 мл амилового спирта, раствор центрифугировали при 3000 об/мин в течение 3 мин, органическую фазу отбрасывали. После этого водную фазу экстрагировали 4 мл диэтилового эфира в течение 3 мин. Раствор центрифугировали при 3000 об/мин в течение 3 мин, органическую фазу отбрасывали. К водной фазе добавляли 1—2 мл 50% раствора едкого натра до рН 10,0—11,0 (по универсальному индикатору), после охлаждения добавляли 1 г кристаллического гидрокарбоната натрия до насыщения раствора. Полученный раствор трижды экстрагировали смесью: хлороформ — изопропанол (9:1) порциями 4, 4, 4 мл. Извлечение фильтровали в градуированную пробирку через слой безводного сульфата натрия, помещенного на небольшой тампон ваты. Объем фильтрата доводили до 12 мл, перемешивали.
2 мл экстракта (соответствующие 1 г печени), 3 мл экстракта (соответствующие 1 мл мочи) и 12 мл экстракта (соответствующие 3 мл крови) испаряли до сухого остатка, добавляли 200 мкл 0,5% раствора фосфорной кислоты в 20% растворе сульфата натрия. Через 1 мин добавляли 50 мкл хлороформа, встряхивали в течение 1 мин, центрифугировали. 5 мкл водной фазы исследовали на жидкостном хроматографе Agilent 1200, «Agilent Technologies» (США) с масс-селективным детектором Agilent 6110 Quadrupole LC/MS с источником ионизации электрораспылением (ES). Режим ES — поток газа-осушителя 12 л/мин, температура газа-осушителя 350 °С, давление nebulizer 45 psig. Детектирование пиков проводили в двух режимах: SIM-1 и SIM-2, как описано выше.
Режим хроматографирования. Колонка стальная размером 4,6×150 мм, заполнена обращенно-фазовым сорбентом Zorbax Eclipse XDB-C18 с размером частиц 5 мкм. Подвижная фаза: раствор А — 0,1% раствор муравьиной кислоты, раствор В — ацетонитрил. Скорость хроматографирования 1 мл/мин. Хроматографирование проводили в градиентном режиме, изменяя содержание ацетонитрила: начальную концентрацию 5% ацетонитрила выдерживали в течение 1 мин, далее увеличивали концентрацию ацетонитрила до 70% в течение 20 мин.
Для расчета концентрации морфина и кодеина в биологическом материале использовали калибровочный график, построенный методом внутреннего стандарта с использованием стандартных растворов морфина, кодеина и налтрексона (внутренний стандарт), которые добавляли к навеске крови, мочи, печени после гидролиза и затем изолировали, как описано выше.
Идентификацию вещества проводили в режиме SIM-1 с использованием программного комплекса AMDIS. Количественное определение морфина и кодеина проводили в режиме SIM-2 по масс-ионам 286, 300 и 342 (налтрексон). Расчет содержания морфина (кодеина) проводили по уравнению Y=m·xb, где: Y — концентрация вещества, мг%, m и b — коэффициенты, х — отношение площадей (вещество/внутренний стандарт).
В табл. 1 и 2
Концентрация добавленного вещества идентифицируется с точностью от 73% (для морфина в количестве 0,0026 мг% в крови) до 130% (для 0,002 мг% морфина в моче), в среднем около 100%. Потери при изолировании в зависимости от концентрации добавленных веществ находятся на уровне 40—60%. Коэффициент корреляции (r) для мочи и печени более 0,99%, для крови — более 98%.
По описанной выше методике были исследованы более 170 образцов биоматериала, поступившего в отделение общих химических методов исследования «Бюро судебно-медицинской экспертизы Департамента здравоохранения Москвы». В крови морфин был обнаружен в концентрациях от 0,001 до 0,38 мг% (в 90% случаев от 0,006 до 0,2 мг%), кодеин — от 0,001 до 0,73 мг% (в 90% случаев от 0,003 до 0,16 мг%). В моче морфин был обнаружен в концентрациях от 0,001 до 7,64 мг% (в 90% случаев от 0,002 до 3,14 мг%), кодеин — от 0,001 до 2,825 мг% (в 90% случаев от 0,002 до 0,97 мг%). В печени концентрации морфина составили от 0,002 до 3,149 мг% (в 90% случаев от 0,012 до 1,28 мг%), кодеина — от 0,002 до 1,12 мг% (в 90% случаев от 0,003 до 0,16 мг%).
Результаты проведенной работы показывают, что одноквадрупольный масс-детектор, сопряженный с ВЭЖХ-системой, с успехом может применяться при определении опиатов в биологическом материале. Предложенный алгоритм идентификации веществ компенсирует технические недостатки детектора по сравнению с тандемной масс-спектрометрией. Для судебно-химических исследований морфина и кодеина в крови, моче и печени разработана и статистически обоснована методика их качественного и количественного определения. Данная методика позволяет надежно идентифицировать вещества в концентрациях от 0,002 мг% со средней погрешностью 9,5%. Концентрация добавленного вещества идентифицируется с точностью около 100%. Потери при изолировании в зависимости от концентрации добавленных веществ находятся на уровне 40—60%. Коэффициент корреляции (r) для мочи и печени — более 0,99%, для крови — более 98%.