Технологии лазерной микродиссекции (LCM) позволяют получать в качестве образцов биологического материала для дальнейшего исследования отдельные клетки. Это, в свою очередь, позволяет решать ряд проблем современной судебно-медицинской генетики, связанных с исследованием сверхмалых количеств биологического материала, на уровне единичных клеток, смешанных следов, содержащих биологический материал от нескольких лиц. Использование LCM дает возможность выделить и проанализировать индивидуальные образцы клеточного материала каждого из компонентов смеси.

Ранее нами был опубликован ряд работ [1—3], посвященных оценке потенциальных возможностей применения технологии LCM для целей молекулярно-генетического судебно-экспертного анализа (генотипирования) ДНК. В частности, нами был разработан методический подход, основанный на использовании технологии LCM в сочетании с типированием митохондриальной ДНК (мтДНК).

Цель настоящей работы — создание методики судебно-экспертного молекулярно-генетического исследования сверхмалых количеств биологического материала, вплоть до отдельной клетки. В результате была создана методика, которая действительно позволяет успешно проводить анализ индивидуализирующих признаков мтДНК в одной-единственной клетке человека [1, 2]. В дальнейшем приобретенный в процессе этой работы опыт был нами успешно использован при разработке экспериментальной методики мультиплексного анализа полиморфных STR-маркеров аутосомной ДНК (аДНК) в объектах, полученных с помощью технологии LCM. Эта методика позволяет достоверно проводить генотипирование хромосомной ДНК (хДНК) в одной мультиплексной реакции в суммарных препаратах из 10—20 диссектированных диплоидных клеток [3].

Не будет преувеличением сказать, что все это — весьма успешная демонстрация возможностей LCM применительно к судебно-экспертному молекулярно-генетическому анализу, поскольку полученные результаты близки к пределам чувствительности используемых в настоящее время аналитических методов. Тем не менее следует подчеркнуть, что эти результаты были получены нами при анализе на уровне лабораторных методик — в модельных условиях и на модельных объектах. Перенос же лабораторных технологий в условия реальной экспертной практики таит в себе много сложностей и требует углубленных дополнительных исследований. На самом деле, наши попытки прямо применить разработанные ранее методики для анализа биологических следов, присутствующих на реальных вещественных доказательствах, во многих случаях не приводили к успеху, несмотря на то что количество взятых для генотипирования диссектированных клеток могло быть далеко не минимальным. В последующих экспериментах, проведенных на реальных экспертных объектах, нами был выявлен ряд проблемных аспектов применения технологии LCM в практической экспертной деятельности [4].

В настоящей работе мы целенаправленно изучили некоторые из этих проблем, связанные с характеристиками анализируемых клеток и их физическим состоянием в объекте исследования.

Объекты исследования

Объектом исследования служили микропрепараты буккального эпителия и иных клеток человека, присутствующих в биологических следах, предоставленных для экспертизы. Смытые с поверхности материала-носителя клетки суспендировали в буфере TE (pH 8,0), концентрировали путем центрифугирования и наносили на предметное стекло, покрытое полимерной PEN-мембраной («Leica Microsystems», Германия).

Нанесенный на мембрану клеточный материал обрабатывали, как описано в работе [1].

Диссекция клеточного материала

Лазерная диссекция клеток проводилась с использованием микродиссектора Leica Laser Microdissection System LMD 7000 («Leica Microsystems», Германия). Диссектированный материал собирали в коллектор, в качестве которого использовали типовые пробирки для ПЦР вместимостью 0,2 мл («Axigen», США).

Лизис клеток и постановка ПЦР

Лизис клеток осуществлялся непосредственно в реакционной смеси в процессе термоциклирования в ходе ПЦР. В указанные пробирки-коллекторы вносили готовую реакционную смесь для ПЦР, содержащую необходимые компоненты для энзиматической мультиплексной амплификации STR-локусов и локуса Amel хДНК панели AmpFlSTR Minifiler PCR Amplification Kit («Applied Biosystems», США) или компоненты описанной ранее реакционной системы для энзиматической амплификации локусов ГВС-1 и ГВС-2 мтДНК [1], а также реагенты для ПЦР-сопряженного лизиса клеток и (в случае сперматозоидов) дитиотрейтол.

Генотипирование полиморфных локусов аДНК

Анализ полиморфизма длины амплифицированных фрагментов (ПДАФ) проводили с использованием системы капиллярного электрофореза ABI PRISM 3130 («Applied Biosystems», США) согласно инструкциям производителя.

Отправной точкой в данной работе послужило следующее наблюдение. На судебно-экспертное молекулярно-генетическое исследование был представлен окурок сигареты. Генотипирование хромосомных маркеров в следах слюны на окурке выявило смешанный генотип, и сложный характер смешения не позволял установить генотипы фигурантов. Тогда смытый с поверхности окурка клеточный материал был использован для приготовления микропрепарата, из которого путем LCM были диссектированы 9 единичных клеток. В этих клетках индивидуально провели типирование мтДНК по описанной ранее методике [1, 2].

Примечательно, что на этапе амплификации положительный результат был получен только для пяти из девяти диссектированных эпителиоцитов.

Полученные ПЦР-продукты были подвергнуты последующему секвенированию, и для всех этих клеток удалось установить индивидуальные последовательности мтДНК. В результате в трех из пяти клеток был установлен один общий гаплотип, а в двух оставшихся — другой, отличный от первого (рис. 1, на цв. вклейке).

Тем не менее еще раз отметим, что для четырех из девяти диссектированных клеток продукты амплификации получены не были. Причина этого могла заключаться в природе объекта: ранее в качестве модельной системы мы успешно исследовали свежие буккальные клетки, а на этот раз клеточный материал был получен из застарелого, высохшего окурка.

Для проверки этого предположения был проведен ряд контрольных экспериментов: окурки сигарет выдерживали разное время (от нескольких дней до 1 года) в естественных условиях внешней среды. При этом наблюдалось возрастание доли дисcектированных эпителиоцитов, демонстрировавших отсутствие продуктов амплификации. Количество положительных результатов составляло около 30% для следов одно-двухмесячной давности, а после полугода практически все результаты были отрицательные.

Эффект снижения результативности генотипирования на уровне единичных клеток при исследовании архивного материала по сравнению со свежими клетками буккального эпителия был отмечен нами и в экспериментах по типированию хромосомных STR-локусов. При этом во всех случаях на макроуровне, т.е. при генотипировании обычных препаратов экстрагированной из тех же следов ДНК, никаких затруднений не отмечалось.

Эти результаты позволили выявить существенный недостаток предложенной ранее экспериментальной методики, а именно: недостаточную эффективность лизиса исследуемого клеточного материала.

Напомним, что в предложенной нами ранее аналитической схеме диссектированные клетки не подвергались какой-либо специальной обработке с целью их разрушения и экстрагирования ДНК [1—3]. Лизис клеток и разрушение внутриклеточных структур осуществлялись пассивно, непосредственно в реакционной смеси в процессе термоциклирования в ходе ПЦР. Однако, по всей видимости, клетки, подвергшиеся длительному воздействию факторов внешней среды, оказались весьма устойчивыми к термическому воздействию. Вследствие этого высвобождение молекул ДНК в реакционную среду либо вообще не происходило, либо происходило в крайне малых количествах и на более поздних циклах ПЦР. Очевидно, что снижение доступности генетического материала оказалось причиной резкого снижения эффективности ПЦР.

Для преодоления этого осложнения в предложенную схему анализа нами была введена дополнительная стадия активного лизиса клеток.

Как уже говорилось ранее, в данном случае не могут быть применены типовые методики экстрагирования и очистки ДНК [3], и единственно приемлемым решением является ПЦР-сопряженный лизис клеток. Использованное нами ранее термическое разрушение клеток — один из наиболее простых его вариантов. Для повышения эффективности этой процедуры может быть применен ПЦР-совместимый лизис, основанный на использовании в качестве лизирующих агентов мягких детергентов, не оказывающих ингибирующего влияния на ДНК-полимеразу, но способствующих разрушению структурных компонентов клеточных мембран на начальных этапах термического воздействия в ходе ПЦР. В результате обсуждения этого вопроса одним из авторов статьи на семинаре Applied Biosystems («Foster City», США, 13—19 июня 2010) компанией был предложен вариант в виде лизирующего реагента из набора PrepSEQ Rapid Spin Sample Preparation Kit. Однако его недостатком явилась сравнительно низкая диссоциирующая способность используемых детергентов, не всегда позволяющая достичь требуемого результата.

Этот недостаток можно было бы преодолеть, если дополнить набор ПЦР-совместимых лизирующих агентов еще одним компонентом, а именно протеиназой К. Данный фермент, обладающий высокой протеазной активностью, легко может быть подвергнут термической деактивации и превращен в инертный белок, не препятствующий работе ДНК-полимеразы.

Исходя из этих соображений, мы разработали эффективную систему ПЦР-совместимого лизиса диссектированных клеток на основе лизирующего реагента из набора PrepSEQ Rapid Spin Sample Preparation Kit («Applied Biosystems», США), в который дополнительно была введена протеиназа К («Qiagen», Германия), совмещающая в себе преимущества как протеиназного лизиса, так и использования ПЦР-совместимых детергентов.

С целью повышения эффективности используемой системы лизиса в отношении таких устойчивых к воздействию протеолитических ферментов объектов, как клеточные мембраны сперматозоидов, в состав лизирующего раствора дополнительно был введен тиовосстановитель дитиотрейтол.

Эффективность предложенной методики проиллюстрирована на рис. 2 (см. на цв. вклейке).

Следующим шагом на пути адаптации предложенных методик к реальным объектам послужило осознание и затем экспериментальная проверка фактов неоднородности и неравноценности для анализа клеточного материала, могущего присутствовать в экспертном материале.

Индивидуальные буккальные клетки, присутствующие на старом окурке, были диссектированы, проведены через модифицированную процедуру ПЦР-совместимого лизиса (см. выше) и подвергнуты генотипированию. В среднем для 20% исследованных единичных клеток амплифицировать ДНК не удалось.

В нескольких других экспертных исследованиях нами была предпринята попытка анализа в общей сложности 30 единичных клеток эпидермиса с ладонной поверхности рук человека, изъятых с орудия преступления, однако ни для одной из исследованных клеток положительный результат получен не был, несмотря на использование модифицированной процедуры ПЦР-совместимого лизиса.

Известно, что качество генетического материала, содержащегося в клетках разного типа, может существенно различаться [5]. Нами были проведены эксперименты по окрашиванию микропрепаратов с полученным клеточным материалом флюоресцентным красителем бромистым этидием (EtBr), специфичным для ДНК. Окрашенное клеточное ядро рассматривалось как индикатор целости внутриклеточной структуры, а следовательно, наличия в этих клетках органелл и пригодного для исследования генетического материала. С помощью флюоресцентной микроскопии было установлено, что присутствующий на исследованном окурке эпителий представлен наряду с ядросодержащими клетками также и безъядерными клетками (рис. 3, а, б, на цв. вклейке).

В случае буккальных клеток это вполне могло быть следствием процессов биодеградации эпителиоцитов в условиях их высыхания и длительного хранения. В свою очередь, клетки наружных слоев ороговевающего эпителия, как правило, представляют собой мертвые клетки, полностью утрачивающие в процессе кератинизации клеточные органеллы (в том числе клеточное ядро и митохондрии) и не содержащие полноценного генетического материала [6]. Это и продемонстрировали наши эксперименты.

Подобных вариантов может быть много. Результаты наших экспериментов по окрашиванию EtBr различных типов эпителиальных клеток, полученных от одного и того же донора, продемонстрировали существенные различия в содержании пригодного для исследования клеточного материала в смывах, полученных с разных частей тела человека. У разных индивидуальных доноров результаты окрашивания одинаковых типов эпителиальных клеток также сильно разнятся.

Проведенные эксперименты наглядно демонстрируют существенные различия качества исследуемого материала в зависимости как от типа исследуемых клеток и их состояния (в частности, обусловленного условиями изъятия и хранения материала), так и от индивидуальных особенностей организма конкретного человека.

Таким образом, полученные данные дают основания полагать, что отсутствие матричной активности ДНК при анализе отдельных клеток, полученных с помощью LCM, может объясняться отсутствием в них пригодного для анализа генетического материала.

Этот вывод может оказаться актуальным для самых разных объектов экспертного исследования. Из этого следует, что для подобных объектов, представленных преимущественно структурно неполноценным клеточным материалом, генотипирование ДНК на уровне единичных клеток может оказаться трудновыполнимым. Положительный результат для такого рода объектов может быть получен, но лишь при анализе относительно большого числа клеток (т.е. на макроуровне), а значит, просто за счет статистической представленности в таком препарате достаточного количества полноценных клеток.

В случае же принципиальной необходимости анализа единичных клеток наиболее рациональным решением представляется предварительная окраска клеточного материала ДНК-детектирующими красителями, что позволит прогнозировать эффективность анализа и отбирать для диссекции именно те клетки, в которых сохранилась ДНК. Для этой цели могут быть рекомендованы интеркалирующие флюоресцентные красители, возбуждаемые в относительно длинноволновой области спектра.

В заключение хотим привести еще один интересный пример из нашей практики, наглядно демонстрирующий существование скрытых проблем в судебно-экспертном применении технологий LCM, связанных с особенностями реальных объектов судебно-экспертного исследования.

На молекулярно-генетическую экспертизу был предоставлен тампон с влагалищным содержимым трупа женщины, ставшей жертвой изнасилования. Проведенные исследования смешанных биологических следов на тампоне обычными методами дифференциального лизиса спермального и эпителиального компонентов позволили установить в них лишь генотип самой потерпевшей, который ввиду существенного количественного доминирования биологического материала жертвы практически полностью подавлял амплификацию минорного спермального компонента. Типирование ДНК Y-хромосомы успеха не принесло ввиду запредельно низкого содержания спермального компонента.

Смыв клеточного материала с тампона был подвергнут микроскопическому исследованию. В полученном препарате были выявлены единичные сперматозоиды (рис. 4, на цв. вклейке).

Тем не менее удалось диссектировать порядка 30 индивидуальных сперматозоидов (рис. 5, на цв. вклейке).

Генотипирование диссектированного эпителиального компонента показало генетический профиль потерпевшей, идентичный установленному ранее на уровне макропрепарата. Однако анализ спермального компонента вызвал удивление: был получен смешанный профиль, содержащий почти в равных долях генотип потерпевшей и другой, очевидно, мужской генотип (рис. 6, на цв. вклейке).

В данном случае, несмотря на возникшие трудности, обусловленные предельно малым количеством доступного для исследования биологического материала и сложным смешанным характером анализируемых следов, применение технологии лазерной микродиссекции все-таки позволило получить желаемый результат — установить профиль мужчины, оставившего следы спермы. Отметим, что этот результат оказался недостижим ни одним из обычных методов молекулярно-генетического анализа.

Тем не менее надо помнить, что пока преодолеть вышеописанный негативный эффект смешения генетического материала не удалось. Можно предположить, что причиной такого парадоксального, на первый взгляд, результата послужила агломерация диссектируемого клеточного материала (сперматозоидов) с какими-то компонентами других клеток (в данном случае эпителиоцитов), присутствующих в объекте исследования в существенно большем количестве. Это могли быть ДНК-несущие белковые комплексы или даже свободные молекулы ДНК, образующиеся при разрушении или повреждении клеток.

Этот вопрос требует изучения. В практическом плане, очевидно, определенной доработке должна быть подвергнута стадия подготовки микропрепарата из смыва клеточного материала. На данной стадии должна осуществляться эффективная диссоциация присутствующих надклеточных образований и полное удаление свободных (внеклеточных) ДНК-содержащих компонентов.

Нами проводится работа в этом направлении.