2-метокси-4-аллилгидроксибензол (эвгенол; далее 2-МО-4-АГОБ) широко применяется в качестве полупродукта органического синтеза, антисептика и ароматизатора. В природе данное соединение входит в состав эфирных масел многих растений [1, 2].

2-МО-4-АГОБ — прозрачная, бесцветная, возможно, слегка желтоватая жидкость с температурой кипения 252—254 °С со своеобразным ароматическим запахом [2—4].

2-МО-4-АГОБ токсичен для теплокровных. Его LD₅₀ для крыс при введении в желудок составляет 1930 мг/кг. У крыс, погибших от введения двойной LD₅₀ 2-МО-4-АГОБ, содержание данного вещества в крови составило 235—285 мкг/мл [6]. Отравления теплокровных летальными дозами 2-МО-4-АГОБ характеризуются сравнительно коротким временным отрезком между введением яда в организм и наступлением смертельного исхода. Описаны случаи летального отравления людей 2-МО-4-АГОБ [3, 5, 8].

Широкое применение 2-МО-4-АГОБ, его токсичность, наличие случаев летального отравления обусловливает необходимость изучения этого соединения в судебно-химическом отношении.

Известные методики химико-токсикологического определения 2-МО-4-АГОБ в целом не реализуют всех возможностей использования современных физико-химических методов анализа для достижения высокой чувствительности определения [1, 3, 5].

Цель настоящего исследования — разработка высокочувствительной методики определения 2-МО-4-АГОБ в трупном материале с использованием методов хромато-масс-спектрометрии (ХМС) и высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с диодно-матричным детектированием.

Объектом исследования явился 2-МО-4-АГОБ (фирма «Merck»), содержание вещества не менее 99%.

Ранее показано, что оптимальные условия изолирования 2-МО-4-АГОБ из биологического материала достигаются уже при двукратном настаивании биологического объекта с этилацетатом в тех случаях, когда масса изолирующего агента каждый раз превышает массу биоматериала как минимум в 2 раза, а продолжительность отдельного настаивания составляет не менее 30 мин [8].

В качестве возможных методов очистки 2-МО-4-АГОБ рассмотрены экстракция и колоночная хроматография. Изучались особенности распределения 2-МО-4-АГОБ в системах из двух несмешивающихся жидкостей в зависимости от природы органической фазы, реакции водной фазы, насыщения водного слоя электролитами и органического слоя водой. Исследовали хроматографическое поведение рассматриваемого вещества в колонках диаметром 11 мм, заполненных 10 г силикагеля L 40/100 мкм или 7,5 г сорбента Силасорб С18. Элюат собирали фракциями 2 мл каждая. 2-МО-4-АГОБ обнаруживали во фракциях методом тонкослойной хроматографии — ТСХ (пластины Сорбфил UV-254; подвижная фаза хлороформ—толуол (8:2); наносимый на пластину объем каждой фракции 10 мкл).

Проводили контрольное хроматографирование на колонке извлечения из 25 г трупной печени человека, заведомо не содержащей 2-МО-4-АГОБ. Фракции элюата, в которых возможно присутствие анализируемого вещества, объединяли, испаряли и растворяли остаток в 10 мл ацетона. 2,5 мл полученного раствора упаривали до сухого остатка. Остаток растворяли в 25 мл смеси растворителей ацетонитрил — 0,025 М раствор дигидрофосфата калия (6:4) и измеряли оптическую плотность раствора при 281 нм (смесь растворителей и длина волны соответствуют условиям определения методом обращенно-фазовой ВЭЖХ).

Для обнаружения и идентификации анализируемого соединения изучена возможность применения хроматографии в тонких слоях гидроксилированного (широкопористый силикагель на пластинах Сорбфил UV-254) и привитого (пластины Сорбфил UV-254, обработанные вазелиновым маслом, модель привитой фазы С₁₄ — С₁₅) сорбентов. Хроматографическую активность 2-МО-4-АГОБ изучали в присутствии некоторых близких по структуре соединений.

Для подтверждающей идентификации 2-МО-4-АГОБ применены методы ВЭЖХ и ХМС.

При использовании ВЭЖХ в качестве неподвижных фаз рассмотрены сорбенты с гидроксилированной (Силасорб-600) и привитой (Zorbax SB C8, Nova Pack С18) поверхностями. Хроматографировали на приборе Alliance (фирма «Waters», США) с диодно-матричным детектором.

Идентификацию и количественное определение 2-МО-4-АГОБ методом ХМС проводили, используя хроматограф Agilent 7890 AC с квадрупольным масс-селективным детектором модели 5975C этой же фирмы, снабженный капиллярной колонкой HP-5MS длиной 30 м и диаметром 0,25 мм с неполярной неподвижной фазой (5% фенилметилполисилоксан в виде тонкой пленки толщиной 0,25 мкм).

Показано, что 2-МО-4-АГОБ хорошо экстрагируется многими органическими растворителями из растворов с кислой, нейтральной и слабощелочной реакцией (рН от 1,0 до 9,0—12,0). Низкие значения степени извлечения 2-МО-4-АГОБ отмечены при экстракции гексаном и диэтиловым эфиром из сильнощелочных растворов. Оптимальные условия извлечения 2-МО-4-АГОБ из водных растворов достигаются при использовании в качестве экстрагента диэтилового эфира в условиях насыщения водной фазы гексагидратом сульфата натрия при рН 1,0—10,0.

Результаты хроматографии 2-МО-4-АГОБ в макроколонках сорбентов приведены в табл. 1.

Как свидетельствуют полученные данные, наибольшее значение числа теоретических тарелок (n) достигается при использовании колонки силикагеля L 40/100 мкм и подвижной фазы гексан—диоксан—пропанол-2 (40:5:1). В этом случае анализируемое вещество присутствует в 6-й фракции элюата (11—12 мл). Данная система обеспечивает селективное элюирование вещества по отношению к липофильным эндогенным примесям (присутствуют во фракциях с 1-й по 3-ю) и примесям гидрофильного характера (сорбируются в верхней части колонки).

В контрольных опытах с тканью печени, не содержащей 2-МО-4-АГОБ, установлено, что фоновое поглощение раствора ¹/₄ сухого остатка фракций, в которых возможно присутствие рассматриваемого вещества, в смеси ацетонитрил — 0,025 М дигидрофосфат калия (6:4) незначительно и не превышает 0,007 при 281 нм.

Результаты исследования хроматографической подвижности 2-МО-4-АГОБ в тонких слоях сорбентов представлены в табл. 2.

Как видно из табл. 2, оптимальными для хроматографирования данного вещества в тонком слое нормально-фазового сорбента (пластины Сорбфил UV-254) следует считать подвижную фазу хлороформ—толуол (8:2), для варианта обращенно-фазовой ТСХ (пластины Сорбфил UV-254, обработанные вазелиновым маслом) — подвижную фазу ацетонитрил—буфер с рН 1,98 (2:8).

Оптимальным для определения 2-МО-4-АГОБ методом ВЭЖХ являлось использование неподвижной фазы Nova Pack С18 (колонка размером 150×3,9 мм) и элюента ацетонитрил — 0,025 М дигидрофосфат калия (6:4) при температуре колонки 20 °С и скорости элюирования 1 мл/мин. Оптическую плотность измеряли при 281 нм. Время удерживания составило 2,18 мин, коэффициент емкости — 0,45, число теоретических тарелок — 1798, фактор асимметрии пика — 0,90%. Открываемый минимум 2-МО-4-АГОБ методом ВЭЖХ — 0,003 мкг в хроматографируемой пробе.

При определении 2-МО-4-АГОБ методом ХМС начальная температура термостата колонки составляла 50 °С (задержка на 3 мин). Температура программировалась от 50 до 200 °С со скоростью 10 °С в минуту. Температура инжектора составляла 280 °С, интерфейса — 260 °С, квадруполя — 150 °С, источника ионов — 230 °С. Газ-носитель — гелий, подаваемый со скоростью 1 мл/мин. Режим без деления потока с задержкой 1 мин. Детектор работал в режиме электронного удара (70 эВ). Масс-спектр регистрировался по полному ионному току с задержкой 10 мин.

Хроматограмма, полученная в предлагаемых условиях, и масс-спектр анализируемого вещества представлены на рисунке.

На хроматограмме извлеченного из биоматериала вещества по сравнению с хроматограммой стандарта не наблюдаются дополнительные пики и заметное увеличение фонового поглощения. Параметры хроматографирования анализируемого вещества и стандарта совпадают.

Установлено наличие линейной зависимости между содержанием 2-МО-4-АГОБ в хроматографируемой пробе (C) и площадью хроматографического пика (S) в интервале концентраций 0,2—100,0 нг. Исходя из этого строили калибровочный график и рассчитывали его уравнение, которое в данном случае имело вид: S=186 262·C — 6576.

Методика определения 2-МО-4-АГОБ в трупном материале

Изолирование. 25 г искусственной смеси 2-МО-4-АГОБ с мелкоизмельченной тканью печени от трупа человека настаивали 2 раза по 30 мин с порциями этилацетата массой 50 г каждая при перемешивании. Объединенное извлечение пропускали через стеклянный фильтр диаметром 4 см со слоем безводного сульфата натрия толщиной 1,5—2,0 см, слой сульфата натрия промывали 20 мл этилацетата. Фильтраты объединяли, упаривали при комнатной температуре в токе воздуха до объема 0,5—1 мл, а затем — в токе азота до получения сухого остатка.

Очистка извлечений. Сухой остаток растворяли в 10 мл гексана и экстрагировали буферным раствором с pH 12,0—13,0 (по 10 мл 2 раза). Извлечения объединяли, подкисляли 24% раствором хлороводородной кислоты до pH 2,0—3,0, насыщали гексагидратом сульфата натрия и экстрагировали диэтиловым эфиром (по 20 мл 2 раза). Извлечения объединяли, пропускали через стеклянный фильтр диаметром 4 см со слоем безводного сульфата натрия толщиной 1,5—2,0 см, слой сульфата натрия промывали 20 мл диэтилового эфира, фильтраты объединяли и упаривали вначале в токе воздуха при комнатной температуре до объема 0,5—1 мл, а затем в токе азота до сухого остатка. Остаток растворяли в 2—3 мл смеси растворителей гексан—диоксан—пропанол-2 (40:5:1), вносили в колонку размером 490×11 мм с 10 г силикагеля L 40/100 мкм и элюировали смесью гексан—диоксан—пропанол-2 (40:5:1). Элюат собирали фракциями по 2 мл. Фракции 5—7 упаривали до сухого остатка в токе воздуха. Остаток растворяли в 10 мл ацетона. В три выпаривательные чашки (№1, 2 и 3) вносили по 0,05—2,5 мл ацетонового раствора и испаряли растворитель в токе азота.

Идентификация и количественное определение

Определение методом тонкослойной хроматографии (ТСХ). Остаток в чашке №1 растворяли в незначительном объеме хлороформа и наносили на линию старта хроматографической пластины Сорбфил UV-254. Хроматографировали в присутствии вещества-свидетеля, используя подвижную фазу хлороформ—толуол (8:2). Исследуемое вещество идентифицировали по величине Rf, совпадающей с таковой вещества-свидетеля (0,61±0,03).

Определение методом ВЭЖХ. Остаток в чашке №2 растворяли в 10 мл ацетонитрила, раствор переносили в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводили до метки водой. 2—8 мкл полученного раствора вводили в хроматограф. Хроматографировали по описанной выше схеме. Анализируемое соединение идентифицировали по времени удерживания.

Определение методом ХМС. Остаток в чашке №3 растворяли в 25 мл гексана. 2—10 мкл полученного раствора вводили в хроматограф. Процесс хроматографирования и масс-селективного детектирования осуществляли в описанных выше условиях. 2-МО-4-АГОБ идентифицировали по сочетанию сигналов характерных осколков масс-спектра и времени удерживания. Количественное содержание вещества рассчитывали по площади хроматографического пика с использованием уравнения градуировочного графика. Результаты представлены в табл. 3.

Как свидетельствуют полученные данные, при содержании 2-МО-4-АГОБ в биологическом материале от 0,01 до 25,0 мг при постоянной массе навески трупной печени (25 г) изменение среднего значения степени извлечения незначительно и не превышает 0,6%.

Разработанная методика позволяет определить в модельных смесях с тканью трупной печени до 82,94—85,51% 2-МО-4-АГОБ от первоначально внесенного количества с достаточными для подобного рода исследований воспроизводимостью и правильностью. Открываемый минимум — 8·10^-6 г анализируемого вещества в 100 г биоматериала.

1. Изучены особенности экстракции 2-метокси-4-аллилгидроксибензола из водных растворов и результаты хроматографии рассматриваемого соединения в тонких слоях и макроколонках сорбентов с гидроксилированной и привитой поверхностью.

2. Показана возможность очистки исследуемого соединения от эндогенных веществ биологических тканей сочетанием жидкость-жидкостной экстракции и колоночной хроматографии низкого давления.

3. Разработана методика идентификации и количественного определения 2-метокси-4-аллилгидроксибензола в биологическом материале с использованием методов ТСХ, ВЭЖХ и ХМС.