Применение технологии лазерной микродиссекции — LCM (от англ. Laser Сapture Мicrodissection) [1] для молекулярно-генетического экспертного анализа биологических объектов — одно из направлений, развитие которых в последнее время становится все более динамичным именно в судебной науке.
Это обусловлено теми возможностями, которые дает данный метод для решения задач судебной генетической экспертизы вещественных доказательств биологического происхождения, а именно: LCM позволяет получать в качестве образцов биологического материала для дальнейшего молекулярного анализа отдельные клетки. Возможность же выполнения молекулярно-генетического анализа на уровне одной клетки в свою очередь позволяет решить ряд проблем современной судебно-медицинской генетики, связанных с исследованием как сверхмалых количеств биологического материала, содержащегося в одной-единственной клетке [2—5], так и биологических следов смешанной природы, содержащих биологический материал от нескольких лиц. Использование LCM дает возможность выделять и анализировать индивидуальные образцы клеточного материала каждого из компонентов смеси [6].
Тем не менее важно понимать, что на данном этапе развития технологии LCM ее использование в области судебной медицины носит экспериментальный характер, требуются всесторонняя оценка реальных возможностей метода и разработка полноценных экспертных методик.
Некоторое время назад нами был разработан методический подход, основанный на использовании технологии LCM в сочетании с типированием митохондриальной ДНК (мтДНК) для судебно-экспертного молекулярно-генетического анализа ДНК единичных клеток. Было показано, что описанная методика действительно позволяет успешно проводить анализ индивидуализирующих признаков мтДНК в единственной клетке человека [3, 4].
В настоящей работе нами проведена оценка возможностей применения технологии LCM для экспертного анализа (генотипирования) хромосомной ДНК (хДНК) человека.
Материал и методы
Объекты исследования
Объектом исследования служили клетки буккального эпителия человека. Свежие мазки со слизистой оболочки ротовой полости суспендировали в буфере TE (pH 8,0), клетки концентрировали путем центрифугирования и наносили на предметное стекло, покрытое полимерной PEN-мембраной («Leica Microsystems», Германия).
Нанесенный на мембрану клеточный материал высушивали при комнатной температуре в течение 1 ч. Полученный препарат обессоливали и отмывали от возможных примесей свободных молекул ДНК и фрагментов разрушенных клеток деионизированной водой в течение 1 мин. Препарат повторно высушивали и фиксировали в течение 20 мин в 96% этиловом спирте.
Диссекция клеточного материала
Лазерная диссекция клеток проводилась с использованием микродиссектора Leica Laser Microdissection System LMD 7000 («Leica Microsystems», Германия). Диссектированный материал собирали в коллектор, в качестве которого использовали типовые пробирки для ПЦР вместимостью 0,2 мл («Axigen», США).
Лизис клеток и постановка ПЦР
В указанные пробирки-коллекторы вносили по 25 мкл готовой реакционной смеси для ПЦР, содержащей необходимые компоненты для энзиматической мультиплексной амплификации восьми полиморфных STR-локусов и локуса Amel хДНК панели AmpFlSTR Minifiler PCR Amplification Kit («Applied Biosystems», США). Диссектированные клетки не подвергались какой-либо специальной обработке с целью их разрушения и экстрагирования ДНК. Лизис клеток осуществлялся непосредственно в реакционной смеси в процессе термоциклирования в ходе ПЦР.
Генотипирование полиморфных локусов аутосомной ДНК
Анализ полиморфизма длины амплифицированных фрагментов (ПДАФ) проводили с использованием системы капиллярного электрофореза ABI PRISM 3130 («Applied Biosystems», США) согласно инструкциям производителя.
Результаты и обсуждение
Выбор в нашей предшествующей работе [3, 4] в качестве аналитического объекта мтДНК был обусловлен в частности тем, что основной проблемой, препятствующей использованию LCM для генотипирования хДНК, является неустойчивость результатов, получаемых с применением мультиплексных ПЦР-панелей в препаратах, содержащих крайне малое количество исходного генетического материала (именно мультиплексы, как правило, используются в настоящее время для типирования STR-локусов хДНК). Как альтернатива, результативным и устойчивым методом анализа очень малого количества ДНК, такого, например, какое содержится в единичной клетке, представлялся нам вариант монолокусного типирования мтДНК [7, 8], который обладает достаточно большим дискриминирующим потенциалом и высокой чувствительностью. Преимуществом монолокусной системы типирования перед мультилокусными мультиплексными панелями является гораздо более высокая стабильность и возможность применения многораундовой амплификации, многократно повышающей чувствительность анализа без снижения качества результата.
Нами была осуществлена оптимизация условий амплификации полиморфных локусов мтДНК в препаратах, содержащих крайне малое количество исходного генетического материала. Для этого использовали схему двухраундовой ПЦР, которая позволила получить достаточное для секвенирования количество амплифицированного материала. На последующих этапах работы данная система была успешно протестирована на клеточном материале и было показано, что она действительно позволяет успешно проводить анализ индивидуализирующих признаков мтДНК в единственной клетке.
Приобретенный в процессе этой работы собственный опыт [3, 4] и зарубежные научные публикации [2, 5, 6, 9, 10], затрагивающие эту проблему, побудили нас вернуться к оценке возможностей применения технологии LCM для экспертного анализа индивидуализирующих признаков на уровне хДНК.
В настоящей работе была поставлена задача разработать экспериментальную методику анализа полиморфных STR-маркеров аутосомной ДНК в объектах, полученных с использованием технологии LCM, и с ее помощью оценить перспективы и возможности данного методического подхода в решении практических экспертных задач.
В рамках этой работы была определена и реализована приводимая ниже схема исследования, содержащая четыре основных этапа.
1. Подготовка микропрепарата исследуемого объекта
Подготовка микропрепаратов исследуемых объектов проводилась, как описано в разделе «Материал и методы», в целом она аналогична описанной нами ранее методике подготовки микропрепаратов для типирования мтДНК [3, 4, 11].
2. Определение интересующих клеточных структур в полученном препарате
Данный этап включал подбор эффективных методов контрастирования исследуемого микропрепарата и идентификацию морфологических структур, которые подвергаются последующей диссекции.
Проблема заключается в том, что классические методы контрастирования клеточных структур с использованием гистологических красителей (таких как гематоксилин и эозин, краситель метиловый зеленый и др.) в большинстве своем оказывают негативное влияние на сохранность генетического материала. Это может быть связано с агрессивным воздействием на ДНК как самого красителя, так и применяемых фиксаторов [12, 13]. Таким образом, в случае анализа предельно малых количеств биологического материала ввиду необходимости достижения максимальной эффективности проводимого молекулярно-генетического анализа использование химических методов контрастирования следует признать неприемлемым.
Вместо этого могут быть использованы флюоресцентные интеркалирующие красители, которые не вступают в химические реакции с анализируемыми молекулярными мишенями поли- и олигонуклеотидной природы, такие, например, как SybrGreen, EtBr, DAPI и т.п. Однако в этом случае для оценки приемлемости того или иного красителя, следует учитывать свойственную ему длину волны возбуждающего света, чтобы по возможности минимизировать повреждающее воздействие излучения на ДНК.
С учетом этих соображений мы в своей работе сделали выбор в пользу преимущественно физических методов контрастирования исследуемых микропрепаратов, в частности фазово-контрастной микроскопии и микроскопии в темном поле. Эти методы позволяют достаточно эффективно идентифицировать морфологически различимые клеточные образования и в то же время не оказывают негативного влияния на последующие стадии молекулярно-генетического исследования [10].
3. Лазерная диссекция и отбор диссектированных структур
Диссекция требуемого количества клеток осуществлялась с помощью микродиссектора Leica Laser Microdissection System LMD 7000 («Leica Microsystems», Германия), как описано в разделе «Материал и методы».
В зависимости от поставленной задачи диссектированию подвергались единичные клетки или группы из нескольких клеток — от 2 до 7. Отбор диссектированного клеточного материала производили непосредственно в ПЦР-пробирки, в которых в дальнейшем осуществлялся амплификационный процесс.
Следует пояснить, что для диссектированного материала, представленного малым числом клеток, не могут быть применены типовые методики экстрагирования и очистки ДНК, такие как фенол-хлороформная экстракция с последующей ультрамикрофильтрацией или осаждением ДНК спиртами, сорбентные методы выделения и очистки ДНК и др., поскольку они сопряжены с неизбежными существенными потерями исходного генетического материала.
Минимизировать эти потенциальные потери можно, если в качестве матричного препарата для постановки генотипирующих реакций использовать не экстрагированную ДНК, а непосредственно клеточный лизат, который получен таким образом, чтобы содержащаяся в нем ДНК обладала матричной активностью, а остальные клеточные компоненты были разрушены и не препятствовали протеканию ПЦР. Но это не все. Малое исходное количество анализируемого материала диктует необходимость его амплификации в одной реакции. Это значит, что анализируемый клеточный лизат должен стать составной частью реакционной смеси для ПЦР и потому иметь минимально возможный собственный объем. Этому условию наилучшим образом удовлетворяет ПЦР-сопряженный клеточный лизис, при котором непосредственно в амплификационной реакционной смеси происходит разрушение клеток и высвобождение доступной для анализа клеточной ДНК.
Одним из приемлемых вариантов такой системы является термическое разрушение клеток. Мы использовали именно этот вариант. Поэтому в настоящей работе диссектированные клетки не подвергались заранее какой-либо специальной обработке с целью их разрушения и экстрагирования ДНК. Лизис клеток осуществлялся непосредственно в реакционной смеси в процессе термоциклирования в ходе ПЦР.
4. Генотипирование полиморфных локусов хромосомной ДНК
Следует сказать, что молекулярный анализ (генотипирование) полиморфных STR-локусов аутосомной ДНК в диссектированном материале сопряжен со значительными трудностями, из которых главный — это предельно малое количество доступных для исследования однокопийных мишеней ДНК. В этой связи отметим, что в случае использования мультиплексной амплификационной системы при анализе хромосомных STR-локусов, это единственная система, которая способна обеспечить достижение приемлемого дискриминирующего потенциала проводимого анализа), применение многораундовой ПЦР технически невозможно. Это обусловливает объективное ограничение метода. В настоящее время заявленная производителем чувствительность лучших мультиплексных систем генотипирования хромосомных STR-локусов такова, что минимальное количество геномной ДНК, необходимое для достоверной амплификации типичной мультилокусной панели геномных диаллельных однокопийных мишеней, составляет порядка 60—100 пг [14]. Теоретически эта величина эквивалентна 10—20 диплоидным или 30—40 гаплоидным геномам. Отметим, что достижение столь высокой чувствительности возможно лишь при использовании современных систем капиллярного электрофореза, основанных на детекции флюоресцентно меченных амплифицированных фрагментов ДНК.
Таким образом, при имеющемся в настоящее время арсенале методов судебно-экспертного генотипирования хромосомных STR-локусов не может идти речь об анализе хДНК единичной клетки. Для достоверного генотипирования хДНК в одной мультиплексной реакции должен быть амплифицирован генетический материал, содержащийся как минимум в двух—трех десятках диссектированных клеток.
В настоящей работе эта потенциальная возможность была нами реализована и оценена с практической точки зрения.
Вышеописанная методика была испытана на модельных препаратах буккальных эпителиоцитов. Для генотипирования хДНК была выбрана мультиплексная 8-локусная панель полиморфных STR-маркеров хДНК AmpFlSTR Minifiler PCR Amplification Kit («Applied Biosystems», США) как обладающая необходимой высокой чувствительностью и стабильностью получаемых результатов в сочетании с высоким дискриминирующим потенциалом.
На рис. 1 (на цв. вклейке)
Это действительно успешная демонстрация возможностей, поскольку полученный результат близок к расчетному пределу чувствительности метода. Тем не менее мы не можем утверждать, что генотипирование хромосомной ДНК на уровне 10 клеток — это всегда стабильный и воспроизводимый результат. Стоит обратить внимание на то, что достаточно часто при попытках выполнить исследование с таким малым количеством исходного материала, близким к порогу возможностей используемого метода анализа, наблюдалось появление неустранимых стохастических эффектов, вызванных запредельно низким содержанием в реакционной смеси эффективных ДНК-матриц, которые проявлялись артефактной амплификационной активностью.
Один из таких примеров иллюстрирует рис. 2 (на цв. вклейке).
На основании этих и других полученных нами оценок практических возможностей метода можно заключить, что по состоянию на сегодняшний день количественный порог в 15—20 диплоидных клеток (30—40 гаплоидных) при их прямом генотипировании в одной мультиплексной реакции следует считать предельно допустимым с точки зрения достоверности результата генотипирования. Аналогичные оценки можно найти и в ряде зарубежных работ (цит. по [10]).
Обобщая опыт проведенных нами исследований, считаем целесообразным сформулировать следующие положения.
— Использование дорогостоящей и сложной технологии LCM оправдано в тех случаях, когда компоненты смешанного препарата не могут быть разделены иными методами, либо хотя бы один из компонентов смеси присутствует в количестве, недостаточном для анализа на макроуровне (например, в случае очень малого содержания спермального компонента в смеси с женскими эпителиальными клетками).
— Применение LCM оправдано при анализе препаратов, содержащих, условно говоря, менее 100 клеток. Расчет здесь простой: количество генетического материала, содержащегося в 100 клетках, эквивалентно приблизительно 600 пг аутосомной ДНК, что достаточно для анализа современными методами генотипирования на макроуровне даже с учетом потенциальных потерь на этапе экстракции ДНК.
Что касается проблемы предотвращения контаминации диссектируемых объектов посторонним генетическим материалом, то ввиду критически малых количеств анализируемых биологических образцов она стоит достаточно остро. В наших экспериментах стабильности и воспроизводимости получаемых данных (как критерия их достоверности и относимости к исследованным объектам в смысле ч. 1 ст. 74 УПК РФ) удалось достичь только при строгом соблюдении следующих условий:
— наличие отдельного помещения для лазерной микродиссекции, удаленного от помещения для проведения собственно молекулярного анализа (во избежание контаминации образцов продуктами ПЦР);
— ежедневная влажная уборка с дезинфицирующими средствами (как противопыльная мера) и обработка помещения для лазерной микродиссекции ультрафиолетовым излучением;
— использование в ходе работы полного комплекта сменной (одноразовой) медицинской спецодежды (халат, маска, шапочка, нарукавники, стерильные перчатки);
— использование для каждого этапа методики индивидуального комплекта микропипеток, штативов и других лабораторных инструментов, подвергаемых периодической деконтаминации;
— использование на всех этапах работы только наконечников для микропипеток, снабженных аэрозольными фильтрами, а также одноразовой лабораторной посуды;
— строгий контроль отсутствия контаминации всех используемых растворов и реагентов;
— наличие на всех этапах исследования контрольных препаратов, служащих индикаторами чистоты проводимых экспериментов;
— обеспечение минимального количества физических манипуляций с образцами (открывание и закрывание пробирок, перенос материала из пробирки в пробирку, многократное добавление к образцам реагентов), в идеале — проведение всех стадий анализа в одной единственной пробирке (в нашем случае это достигалось применением ПЦР-сопряженного лизиса).
Перечисленные меры являются минимально необходимыми и потому требуют самого тщательного соблюдения. Не будет преувеличением сказать, что обеспечение достоверности получаемых результатов является ключевой задачей применительно к судебно-экспертным молекулярно-генетическим методикам с использованием технологии LCM.