В последнее время участились случаи отравления клозапином (СZ, азалептин, (8-хлор-11-(4-метил-1-пиперазенил)-5Н-дибензо[b,e][1,4]-диазепин). Чаще всего они связаны с криминальными действиями, реже CZ употребляют в суицидальных целях или случайно [1].

CZ в биологическом материале обнаруживается как в токсических, так и в терапевтических концентрациях, при этом четко установить границу между терапевтическими и токсическими концентрациями очень сложно. Согласно современным токсикологическим данным [2], пороговые концентрации CZ в крови составляют 0,012±0,006 мг%, критические — 0,101±0,020 мг%, смертельные — более 0,350±0,150 мг%. В работе [3] описаны случаи обнаружения CZ в концентрациях 0,2 мг% и выше в 0,4% образцов крови более чем 100 тыс. обследуемых при проведении терапевтического лекарственного мониторинга. При лечении CZ самая высокая концентрация в крови была зафиксирована на уровне 0,495 мг% [3]. В той же работе отмечается, что концентрация CZ в 42,5% образцов составила 0,035 мг% или менее, в 28,4% образцов — более чем 0,060 мг%.

По обобщенным данным, представленным в работе [4], токсический эффект наблюдается уже при концентрации CZ в крови 0,09—0,7 мг%, летальная концентрация составляет 0,13—1,3 мг%. Таким образом, терапевтические, токсические и летальные концентрации CZ в крови очень близки или перекрываются.

Авторы работы [4] представили следующие данные: в печени нетоксические концентрации CZ составляют 0,08—0,15 мг%, токсические — 0,59—1,7 мг%, летальные — 0,65—8,5 мг%. В моче токсическая концентрация 0,43 мг%, летальная — 1,1 мг%. При пероральном отравлении CZ в 7 случаях, описанных в работе [5], концентрация его в крови составила от 0,22 до 2,1 мг%, в печени — от 1,3 до 15,3 мг%.

В настоящее время некоторые специалисты выделяют в отдельную группу криминальное отравление CZ [6, 7], при этом количество вещества в крови находится на уровне терапевтических концентраций — 0,006—0,012 мг/мл. В 60—90% случаев одновременно в крови присутствует этиловый спирт, в среднем около 2‰. Этанол усиливает угнетающее действие CZ на центральную нервную систему, что часто приводит к смертельному исходу.

Таким образом, из представленных данных можно сделать вывод о том, что CZ — высокотоксичное соединение. Границы его токсических и терапевтических концентраций очень близки, при постоянном приеме препарата развивается толерантность. Для исследования CZ необходима методика, позволяющая достоверно определять как токсические, так и терапевтические концентрации, имеющая хорошую воспроизводимость, простую пробоподготовку для максимально очищенных экстрактов. Разработка такой методики и являлась целью нашей работы.

Для исследования CZ в биологических жидкостях и тканях в России чаще всего используют газовую хроматографию с масс-селективным детектором и азотно-фосфорным детектором [8—10]. Однако газохроматографические методы имеют ряд недостатков: термическое превращение метаболита CZ (клозапин-N-оксида) в CZ, а также необходимость дериватизации для повышения чувствительности [8]. Учитывая недостатки этих методов, мы считаем, что для определения CZ следует более широко применять метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).

В многочисленных работах приводятся данные об обнаружении CZ методом ВЭЖХ [11—17] с применением спектрофотометрического или диодно-матричного детекторов в сыворотке, плазме или цельной крови, реже — в биологических тканях, моче, желчи. Однако в представленных работах не обсуждаются особенности исследования трупного материала, не всегда имеется возможность использовать предлагаемые методы пробоподготовки.

Таким образом, учитывая данные по фармакокинетике, токсикокинетике, основные пути метаболизма и распределения CZ в организме человека, современные достижения в области ВЭЖХ, мы разработали методику обнаружения и определения CZ при судебно-химическом исследовании. Методика состоит из следующих этапов:

— изолирование CZ из подщелоченного раствора крови и мочи с применением экстракции органическими растворителями с последующей реэкстракцией веществ перед вводом в хроматограф, из печени CZ изолировали подкисленным ацетонитрилом;

— обнаружение и определение изолятов методом ВЭЖХ с диодно-матричным детектором;

— ВЭЖХ проводили на стандартных обращенно-фазовых колонках с элюцией слабокислыми водными растворами и ацетонитрилом в градиентном режиме.

В качестве внутреннего стандарта использовали налтрексон. Диапазон измеряемых концентраций — от терапевтических до токсических.

Хроматографирование проводили на жидкостном хроматографе Agilent 1200 («Agilent Technologies», США) с диодно-матричным детектором. Режим хроматографического разделения: колонка стальная размером 4,6×150 мм с обращенно-фазовым сорбентом Zorbax Eclipse XDB-C18 с размером частиц 5 мкм. Детектирование проводили при длинах волн от 210 до 600 нм. Опорная длина волны для расчета концентрации CZ — 210 нм. Подвижная фаза — раствор А (0,1% раствор трифторуксусной кислоты), раствор В — ацетонитрил. Скорость хроматографирования 0,7 мл/мин, градиентный режим изменения содержания ацетонитрила: начальную концентрацию 5% ацетонитрила выдерживали в течение 2 мин, далее концентрацию ацетонитрила увеличивали до 60% в течение 20 мин.

Идентификацию CZ проводили по времени удерживания и УФ-спектру, который представлен на рис. 1.

Для обнаружения и определения CZ в крови во флакон вместимостью 9 мл добавляли 200 мкл раствора налтрексона (внутренний стандарт) с концентрацией 0,15 мг/мл и 3 мл крови, перемешивали и настаивали в течение 15 мин. Затем добавляли 3 мл насыщенного раствора тетрабората натрия и экстрагировали смесью гептан—этилацетат—изопропанол (5:5:1) 2 раза по 3 мл. Полученные извлечения фильтровали через 1 г безводного сульфата натрия во флакон вместимостью 9 мл и упаривали досуха. Сухой остаток растворяли в 200 мкл 0,5% раствора трифторуксусной кислоты в 10% растворе ацетонитрила. Через 1 мин добавляли 100 мкл гептана, встряхивали в течение 1  мин и центрифугировали. 20 мкл водной фазы исследовали на жидкостном хроматографе.

Для обнаружения и определения CZ в моче во флакон вместимостью 9 мл помещали 200 мкл раствора налтрексона с концентрацией 0,15 мг/мл и 3 мл мочи, перемешивали и настаивали в течение 15 мин. Затем добавляли 1 г смеси карбонат — гидрокарбонат натрия (1:2). Далее изолировали, как описано выше.

Для обнаружения и определения CZ в печени (почке) 2,0 г (средняя проба из 30 г измельченной биоткани) биоматериала переносили во флакон вместимостью 16 мл, добавляли 4 мл свежеприготовленной смеси ацетонитрил — 18% соляная кислота (9:1). Настаивали при постоянном перемешивании в течение 1 ч на механической мешалке, центрифугировали при 3000 об/мин 15 мин, извлечение сливали с осадка в другой флакон вместимостью 16 мл, содержащий 4 мл 2,5% раствора сульфата натрия. К извлечению добавляли 3 мл гептана, встряхивали, центрифугировали. Гептановый слой отделяли, водно-ацетонитриловую фазу подщелачивали 2 мл 25% раствора аммиака (рН 10,0; по универсальному индикатору) и экстрагировали трижды по 3 мл эфира, центрифугировали 5 мин при 1500 об/мин. Эфирный слой отделяли, объединяли, фильтровали через слой безводного сульфата натрия во флакон вместимостью 9 мл, упаривали досуха. Сухой остаток далее исследовали, как описано выше. Объем вводимой пробы 10 мкл.

Экстракцию проводили на встряхивателе Ротатор программируемый MULTI RS-60 («BioSan», Латвия) со скоростью 80 об/мин в течение 5 мин, центрифугирование проводили 5 мин при 3000 об/мин на центрифуге Eppendorf 5810 («Эппендорф», Германия), упаривание экстрактов проводили в потоке азота. В качестве стандартных веществ использовали налтрексон (кат. номер N3136-100MG) и козапина (кат. номер С6305-25МG) фирмы «Sigma-Aldrich» (США).

Для расчета концентрации CZ в крови, моче, печени (почке) использовали калибровочный график, построенный методом внутреннего стандарта с использованием растворов налтрексона (внутренний стандарт) и CZ (модельные растворы), которые добавляли к биологическому материалу, выдерживали 15 мин и далее изолировали, как описано выше.

В табл. 1 и 2

Для количественного определения проверяли линейную и нелинейную модели калибровки. При расчете концентрации модельных образцов с помощью калибровочного графика, описанного уравнением y = m · x^b, расчетные (Р) и фактически добавленные концентрации CZ практически совпали с точностью 97—102%. Коэффициент корреляции (R) больше 0,99. При расчете концентрации с помощью графика линейного вида правильность определения (Р) для низких концентраций составила 110—120%, следовательно, результаты измерения низких концентраций CZ в биологическом материале давали завышенные значения, что неприемлемо. Это явление, видимо, связано с большим диапазоном измеряемых значений и сравнительно большими потерями при изолировании CZ в низких концентрациях (см. табл. 2).

Для оценки результатов измерения и правильности пробоподготовки мы использовали значение площадей пиков внутреннего стандарта. Согласно калибровочным данным, площадь пика налтрексона составила: для крови — от 5900 мЕА · s до 7700 мЕА · s, для мочи от 4600 мЕА · s до 7500 мЕА · s, для печени — от 2300 до 5100 мЕА · s (объем вводимой пробы 10 мкл). При исследовании экспертного материала мы рекомендуем учитывать представленные данные и, если значение существенно ниже указанного диапазона, необходимо повторить экстракцию. Если наблюдаются завышенные значения площади пиков внутреннего стандарта, возможна ошибка при пробоподготовке или имеется случай злоупотребления налтрексоном. Следует отметить, что налтрексон очень быстро метаболизируется в организме и в неизмененном виде определяется в незначительных количествах. Случаев завышения площади пика налтрексона из-за его употребления в нашей практике не было [18].

Для определения предела обнаружения представленной методики мы исследовали образцы биоматериала, содержащие менее 0,001 мг% клозапина. На рис. 3 и 4

Ограничением для качественного и количественного определения CZ являются высокие концентрации соэкстрактивных веществ в зоне CZ и налтрексона по сравнению с концентрациями исследуемых веществ. В таких случаях необходимо применять другие методы идентификации и количественного определения CZ.

По описанной выше методике было исследовано более 90 образцов биоматериала, поступающего в отделение общих химических методов исследования Бюро судебно-медицинской экспертизы Департамента здравоохранения Москвы. В 36 образцах крови наблюдался CZ в концентрации от 0,002 до 5,90 мг%, в 19 образцах мочи наблюдался CZ в концентрации от 0,002 до 1,533 мг%, в 32 образцах печени — от 0,008 до 13,60 мг%, в 7 образцах почки — от 0,01 до 0,97 мг%.

В 27 (71%) образцах был обнаружен этиловый спирт от 0,2 до 6,5‰. Кроме CZ были обнаружены: карбамазепин в 3 образцах, морфин в 2 образцах, метадон в 2 образцах, галоперидол, дисульфирам, амитриптилин, нифедипин, феназепам, фенобарбитал — в 1 образце.

1. Разработанная методика позволяет определять клозапин в биологических жидкостях и биотканях организма человека при судебно-химическом анализе с применением метода ВЭЖХ с диодно-матричным детектором. Процедура пробоподготовки оптимизирована для исследования на жидкостном хроматографе.

2. Методика статистически охарактеризована, позволяет с точностью выше 97% достоверно определять CZ в диапазоне концентраций от следовых до токсических. Потери CZ при изолировании составили от 40 до 60%, относительная погрешность не превышает 10—11%. Пределы обнаружения и определения находятся на уровне 0,001 мг%.

3. Представлен алгоритм оценки качества изолирования и результатов исследования каждого конкретного образца.