Антибиотикорезистентность является в последнее время одной из наиболее острых проблем в пародонтологии [1]. Появление устойчивых штаммов микроорганизмов поставило перед исследователями задачу найти и использовать в лечении пациентов с воспалительными заболеваниями пародонта эндогенные вещества с антимикробным эффектом [2].

Антимикробные пептиды (АМП) человеческого организма, которые синтезируются в ответ на внедрение чужеродных микроорганизмов, могут оказаться альтернативой антибиотикам. АМП, в частности, α- и β-дефензины, обладают выраженной антибактериальной активностью в отношении широкого спектра пародонтопатогенной микробиоты. Кроме того, дефензины позволяют усилить эффективность антибиотиков, уже используемых при обострениях хронических воспалительных заболеваний пародонта [3].

Дефензины — это катионные пептиды длиной от 30 до 42 аминокислот. Их разделяют на три семейства — α-, β- и θ-дефензины. В организме человека присутствуют два вида: α- и β-дефензины. Гранулы нейтрофилов являются основным депо для α-дефензинов, HNP (Human Neutrophilic Peptide, HNP₁-₃). Они активны против грамположительных и грамотрицательных бактерий.

Дефензины являются наиболее эволюционно древними пептидами, активно участвующими в процессах врожденного иммунитета. О существовании антимикробных пептидов известно уже несколько десятилетий, но только недавно интерес к этим молекулам перешел из плоскости фундаментальных исследований иммунной системы в клиническую область [2]. Пациенты, у которых отсутствуют α-дефензины или наблюдается их дефицит, страдают частыми и тяжелыми бактериальными инфекциями.

Активация нейтрофилов при инфекционных и воспалительных процессах приводит к быстрому высвобождению дефензинов, которые затем обнаруживаются в плазме и других жидкостях организма.

Выраженный синтез антимикробных пептидов сопровождает процесс фагоцитоза инфекционных агентов. Иммунные клетки используют дефензины для уничтожения бактерий, поглощенных при фагоцитозе [3—6].

Дефензины являются амфипатичными молекулами, то есть имеющими как полярные, так и неполярные части, а гидрофильные и гидрофобные участки молекулы четко отделены друг от друга. Это свойство облегчает связывание и встраивание их в фосфолипидную оболочку микроорганизмов.

D. Yang и соавт. ввели понятие неокислительного уничтожения микробов, объясняя, в частности, механизм антибактериального действия дефензинов [4]. Противомикробная активность проявляется примерно через 3—4 ч. с момента взаимодействия с микроорганизмом и наиболее точно представлена на модели Шайа—Мацузаки—Хуанга, которая состоит из трех последовательных ступеней: накопление молекул АМП на поверхности микробных клеток за счет электростатических связей, взаимодействие дефензинов с анионными группировками фосфолипидов мембран и последующее образование сквозных отверстий (пор) в оболочке бактерий и их гибель. Клеточная стенка бактерий хорошо проницаема не только для питательных веществ, но и для таких маленьких молекул, как антимикробный пептид. Положительный заряд молекулы дефензинов способствует возникновению электростатической взаимосвязи между антимикробными пептидами с отрицательно заряженными поверхностными компонентами мембраны.

Молекулы антимикробных пептидов, взаимодействуя с поверхностными структурами бактерии, приобретают правостороннюю спиральную форму, которая предопределяет их проникновение вглубь отрицательно заряженного фосфолипидного слоя мембраны бактерии, нарушая ее целостность и блокируя метаболизм бактериальной клетки.

При достижении критической величины количества пор, пронизывающих мембрану, бактериальная клетка погибает от осмотического шока [6].

Помимо осуществления непосредственного бактерицидного действия, α-и β-дефензины обладают также выраженным иммуномодулирующим действием. Они увеличивают мощность генерации активированных кислородосодержащих метаболитов, которые не только обладают антимикробным действием, но и являются сигнальными молекулами, активирующими экспрессию генов про- и противовоспалительных цитокинов.

Кроме того, установлено, что АМП тормозят фибринолиз в месте воспаления, тем самым увеличивая время воздействия других факторов защиты организма на патогены. В работах van S. Wetering (2008) показано, что дефензины также способны мощно активировать фагоцитоз и индуцировать продукцию интерферона (IFN-γ), а также гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (GM-CSF) [7]

В настоящее время активно изучается возможность антимикробных пептидов противостоять образованию биопленок пародонтопатогенных бактерий [6—9].

А-дефензины (нейтрофильные пептиды (HNP_1—3) обнаружены в тканях слюнных желез, в десневой жидкости и собственно десне. Таким образом, HNP_1—3 взаимодействуют с обширной и разнообразной группой как комменсальных, так и патогенных микробных антигенов. HNP_1—3 обладают способностью непосредственно связываться с адгезинами Porphyromonas gingivalis, основного патогена пародонта, присутствующего в 80% пародонтальных карманов пациентов с тяжелой формой пародонтита [6—9].

Связывание дефензинов с адгезинами P. gingivalis может предотвратить их прилипание к тканям пародонта, ослабить индуцированные адгезином провоспалительные цитокиновые ответы и облегчить доставку связанного антигена к антигенпрезентирующим клеткам [10, 11]

АМП оказывают хемотаксическое действие на различные провоспалительные клетки. А-дефензины человека HNP₁-₃ ослабляют продукцию ФНОα, ИЛ-8, ИЛ-6 и ИЛ-1β, вызванную грамотрицательными бактериями, в макрофагах [2, 6].

Взаимодействие дефензинов с незрелыми дендритными клетками способствует дифференцировке последних в зрелые формы, являющиеся эффективными антигенпредставляющими клетками [2]. Таким образом, дефензины являются адъювантами — соединениями, усиливающими реакции приобретенного (адаптивного) иммунитета, и регулируют выраженность и направленность иммунного ответа.

АМП стимулируют ангиогенез, стимулируют пролиферацию и дифференцировку эпителиоцитов, индуцируют апоптоз и ингибируют синтез ФНОα, что важно на заключительных этапах воспаления.

Дополнительной и хорошо известной функцией является способность антимикробных пептидов, особенно дефензинов, регулировать активацию комплемента. Причем дефензины в зависимости от различных условий могут как активировать классический путь активации комплемента [6], так и ингибировать его. При низких концентрациях АМП активируют, а при относительно высоких — ингибируют.

Нарастающий из года в год научный интерес к биологическому и медицинскому значению α- и β-дефензинов по праву позволяют считать их молекулами, переживающими ренессанс [1, 3].

Универсальность действия на микроорганизмы, а также способность быстро поражать клетки-мишени и широкий спектр действия позволяют рассматривать антимикробные пептиды как один из основных механизмов борьбы с патогенной микробиотой пародонтального кармана и оптимизации воспалительного процесса в пародонте.

Нейтрофилы являются основными продуцентами α-дефензинов. Инвазия патогенов и некоторые другие триггеры приводят к синтезу de novo и локальному высвобождению HNP из гранул нейтрофилов, а затем к появлению этих молекул в системной циркуляции. HNP_1—3 обнаружены в слюне, в протоках слюнных желез, в десневой жидкости и в соединительном эпителии [3, 4].

Синтез АМП может быть индуцирован через рецепторы врожденного иммунитета, в том числе NOD1 и NOD2 (nucleotide-binding oligomerization domain 1 и 2) — сенсоры структурных субъединиц пептидогликана клеточных стенок бактерий [5]. В России разрешен к клиническому применению лекарственный препарат — агонист NOD1 и NOD2, представляющий собой композицию мурамилпептидов (КМП) клеточной стенки грамотрицательных бактерий.

Цель исследования — определение влияния ПМ на содержание α-дефензинов в сыворотке крови и пародонтальных карманах и выявляемость P. gingivalis у пациентов с хроническим пародонтитом.

Материал и методы

В исследование были включены 60 пациентов в возрасте от 28 до 40 лет с агрессивной формой пародонтита.

Критерии невключения: отягощенный аллергологический анамнез, наличие острых или находящихся в стадии обострения хронических инфекционных заболеваний (включая СПИД, гепатит B и C, сифилис, туберкулез); сахарный диабет; аутоиммунные, онкологические и сердечно-сосудистые заболевания; заболевания крови и кроветворных органов; длительная гормональная терапия кортикостероидами; беременность и кормление грудью; психические заболевания; острые инфекционные заболевания на момент осмотра.

Пациенты рандомизированы в две группы по 30 человек: основную и контрольную. Пациентам обеих групп проводили снятие зубных отложений с помощью ультразвукового аппарата Piezon-Master-400 и полировали поверхности корней зубов с применением пародонтальных боров. Всех пациентов обучали правилам гигиены рта с последующим трехкратным контролем. Пациентам основной группы, кроме того, после снятия зубных отложений ежедневно внутримышечно вводили препарат на основе композиции мурамилпептидов по 200 мкг в течение 7 дней.

Концентрацию HNP_1—3 определяли в содержимом пародонтальных карманов и сыворотке крови с помощью иммуноферментного анализа, используя наборы Вектор-Бест (Россия). Биообразцы из пародонтального кармана получали, погружая в него на 2—3 с одноразовый зубной ершик, который затем помещали в пробирку Эппендорф (F.L. Medical, Италия) с 0,5 мл 0,9% раствора NaCl. Содержимое пародонтальных карманов и сыворотку крови замораживали при –20 °C до момента исследования.

P. gingivalis является наиболее значимым, патогенным и распространенным микроорганизмом содержимого пародонтального кармана у пациентов с агрессивной формой пародонтита, его идентифицировали у 80% обследованных пациентов обеих групп, поэтому мы рассматривали его как основного представителя пародонтопатогенной микробиоты.

Амплификацию видоспецифических фрагментов ДНК P. gingivalis в содержимом пародонтального кармана осуществляли методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием готовых специфических праймеров в многоканальном амплификаторе Терцик МС2 (ДНК-Технология, Россия).

Статистический анализ выполняли с помощью программы Statistica 12.0 (StatSoft, США). Различия независимых и зависимых выборок по количественным признакам оценивали по критериям Манна—Уитни и Уилкоксона соответственно. По качественным признакам независимые и зависимые выборки сравнивали с помощью критериев Фишера и МакНемара. Количественные данные на диаграммах представляли как «Me (Q1—Q3; Min—Max)».

Результаты и обсуждение

Исходно P. gingivalis в пародонтальных карманах был выявлен с одинаковой частотой в обеих группах (см. таблицу). Через 7 дней после начала лечения в обеих группах наблюдали тенденцию к снижению этого показателя. При этом в основной группе тенденция была выше по амплитуде и очень близка к статистически значимому сдвигу. В контрольной группе через 21 день у большинства больных вновь выявляли P. gingivalis, а через 3 месяца доля пациентов с выявленным пародонтопатогеном полностью возвращалась к исходным значениям. У пациентов, получавших ПМ, с 21-го дня наблюдали стойкое и статистически значимое снижение этого показателя на протяжении всего срока наблюдения.

Таблица 1. Влияние препарата на основе композиции мурамилпептидов на выявляемость P. gingivalis в пародонтальных карманах у больных хроническим пародонтитом

Примечание. Статистическая значимость различий с (а) контрольной группой: * — p<0,05; (б) показателями до лечения: ^# — p=0,067, ^## — p=0,015, ^### — p=0,0001.

До лечения концентрация HNP_1—3 в пародонтальных карманах пациентов контрольной группы была несколько выше, чем в контроле, и существенно не изменялась по ходу исследования (рис. 1). У пациентов основной группы во все сроки, начиная с 7-го дня от начала лечения, отмечали повышение уровня указанных α-дефензинов с пиком на 21-е сутки исследования. При этом через 21 и 90 дней концентрация HNP_1—3 статистически значимо превышала таковую в контрольной группе.

Рис. 1. Влияние препарата на основе композиции мурамилпептидов на концентрацию HNP_1—3 в пародонтальных карманах пациентов с агрессивной формой пародонтита.

Данные представлены как «Me (Q1-Q3; Min-Max)». Символом «×» указаны средние, «^●» и «^○» — выбросы. Статистическая значимость различий с (а) контрольной группой: * — p<0,05; (б) показателями до лечения: ^# — p=0,009.

Исходно группы были сопоставимы по уровню HNP_1—3 в сыворотке крови (рис. 2). В контрольной группе этот показатель в дальнейшем практически не изменялся. В результате внутримышечных инъекций препарата на основе композиции мурамилпептидов к 7-му дню концентрация HNP_1—3 повышалась, достигала пика к 21-м суткам и через 3 мес. по-прежнему была выше исходных значений. Через 21 и 90 дней от начала лечения различия основной группы с контролем по этому показателю были близки к порогу статистической значимости.

Рис. 2. Влияние препарата на основе композиции мурамилпептидов на концентрацию HNP_1—3 в сыворотке крови пациентов с агрессивной формой пародонтита.

Данные представлены как «Me (Q1-Q3; Min-Max)». Символом «×» указаны средние, «^●» — выброс. Статистическая значимость различий с (а) контрольной группой: * — p=0,101, ** — p=0,067; (б) показателями до лечения: ^# — p<0,05.

Увеличение концентрации HNP_1—3 в пародонтальном кармане и сыворотке крови пациентов основной группы с 7-го дня исследования отражает активацию компонентов врожденной иммунной системы под влиянием исследуемого препарата. HNP_1—3 обладают как про-, так и противовоспалительными свойствами [6], а данные об изменении продукции и роли этих пептидов у больных пародонтитом противоречивы. В одной из ранних работ установлено снижение способности нейтрофилов вырабатывать HNP_1—3 у пациентов с генерализованным пародонтитом [7]. Позже выявили повышение липополисахарид-индуцированной экспрессии мРНК HNP_1—3 в нейтрофилах у лиц с пародонтитом, хотя продукция самих пептидов не отличалась от таковой у здоровых доноров [8]. M. Puklo и соавторы показали, что уровень HNP_1—3 в десневой жидкости повышался у пациентов с агрессивным и хроническим пародонтитом соответственно в 15 и 60 раз и коррелировал со степенью обсемененности тканей пародонта P. gingivalis, Tannerella forsythia и Treponema denticola [9]. O. Türkoğlu и соавторы представили другие данные: концентрации HNP_1—3 в десневой жидкости больных пародонтитом и гингивитом были сходны между собой и с таковой у здоровых лиц и не отражали степень поражения пародонта [10].

В настоящей работе связанный с применением препарата на основе композиции мурамилпептидов подъем уровня HNP_1—3 в содержимом пародонтальных карманов и системной циркуляции представляется саногенетическим событием. Этот подъем коррелировал с эрадикацией P. gingivalis, что можно объяснить не только непосредственным киллингом патогенов этими АМП, но и способностью HNP_1—3 блокировать формирование биопленок и адгезию P. gingivalis к тканям пародонта [11]. Антимикробное действие иммуномодулирующего препарата может быть связано и с другими NOD1/2-зависимыми иммунными механизмами [5]. Полученные результаты в целом согласуются с ранее опубликованными данными о клинической эффективности препарата на основе композиции мурамилпептидов в комплексном лечении генерализованного пародонтита тяжелой степени [12—14].

Заключение

Доказана способность препарата на основе композиции мурамилпептидов потенцировать эрадикацию P. gingivalis за счет стимуляции выработки HNP_1—3 и подтверждена целесообразность применения этого иммуноактивного препарата в комплексном лечении агрессивных форм пародонтита.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare that there is no conflict of interest.