Роль сигнального пути Sonic Hedgehog в формировании плоскоклеточного рака слизистой оболочки рта

В молекулярных механизмах формирования раковых опухолей принимают участие различные сигнальные пути, которые отвечают за регуляцию клеточной пролиферации, миграцию клеток и апоптоз [1]. Одним из подобных сигнальных путей является Sonic Hedgehog (SHH), который в норме функционирует в эмбриональных и стволовых соматических клетках. В условиях патологии его активация происходит при злокачественной трансформации клеток [2]. Эффекторным белком данного сигнального пути является белок Gli-1. Он содержит цинк-пальцевый домен, способствующий связыванию с участком ДНК, который необходим для контроля транскрипции пути SHH [3].

Поскольку отмечается тенденция к увеличению заболеваемости плоскоклеточным раком (ПР) слизистой оболочки рта (СОР) и то, что выявление данной патологии в большинстве случаев происходит на поздней стадии заболевания, когда вероятность метастазирования увеличивается [4, 5], изучение особенностей синтеза белка Gli-1 в процессе малигнизации эпителия СОР может способствовать подбору иммуногистохимических (ИГХ) маркеров для ранней диагностики ПР СОР.

Цель данного исследования — изучить особенности локализации эффекторного белка Gli-1 сигнального пути SHH в зависимости от степени злокачественной трансформации эпителия СОР.

В работе использовали операционный материал отделения хирургической стоматологии (зав. — д.м.н. В.А. Семкин) и архивный материал лаборатории патологической анатомии (зав. — д.м.н., проф. И.И. Бабиченко) ЦНИИС и ЧЛХ Минздрава Р.Ф. за период с 2010 по 2017 г. Были исследованы биоптаты СОР 43 пациентов (28 женщин и 15 мужчин), средний возраст которых был 64,2 года, с клиническим диагнозом лейкоплакии и ПР СОР. В 10 (23,3%) случаях на основании гистологического исследования поставлен диагноз очаговой эпителиальной гиперплазии (ОЭГ) СОР, в 10 (23,5%) случаях — диагноз плоскоклеточной внутриэпителиальной неоплазии (Squa-mous Intrae-pithelial Neoplasia — SIN). В 13 (29,5%) случаях при морфологическом исследовании выявлен ПР СОР. В качестве контрольной группы были отобраны 10 случаев неизмененной слизистой оболочки с диагнозом фибромы СОР без воспалительных изменений и реактивных гиперпластических процессов (7 женщин и 3 мужчин; средний возраст — 61,7 года).

Гистологическое и ИГХ-исследования биопсийного материала проводились в соответствии со стандартным протоколом [4]. Тканевые антигены определяли с помощью мышиных моноклональных антител к Ki-67 (ММ1, «Diagnostic Biosystems») и кроличьих моноклональных антител к Gli-1 (EPR4523, «Epitomics»). Для визуализации антигенов использовали систему QUANTO на основе пероксидазы хрена и диаминобензидина.

Индекс пролиферации (ИП) по Ki-67 определяли по отношению количества клеток с иммунореактивными ядрами к общему количеству клеток. Наличие белка Gli-1 оценивали по интенсивности окрашивания цитоплазмы клеток: 0 — реакции не отмечалось; 1 — слабое окрашивание; 2 — умеренное окрашивание; 3 — интенсивное окрашивание.

Большая часть пролиферирующих клеток при ОЭГ и SIN локализована в нижних 2/3 эпителия, поэтому оценка экспрессии белков Ki-67 и Gli-1 проводилась в 300 клетках двух зон эпителия: 1-я зона — ростковая зона эпителия (мальпигиев слой), к которой относятся базальный слой и два лежащих выше ряда клеток, и 2-я зона — шиповатый слой эпителия. При П.Р. СОР выделены центральная и периферическая зоны опухоли. Периферическую зону ПР сравнивали с ростковым слоем в неизмененном эпителии при ОЭГ и SIN, а центральную зону ПР — с шиповатым слоем эпителия. Показатели определяли в соответствующих участках тканей. Подсчет клеток проводили при увеличении 400.

Для количественной оценки результатов проводились морфометрические исследования. Статистический анализ осуществляли при помощи программы Statistica 10.0 в среде Windows 7; после исследования нормальности распределения данных по W-критерию Шапиро—Уилка достоверность различий для количественных признаков с нормальным распределением оценивали с использованием теста Стьюдента; при этом определяли среднее арифметическое (М) и стандартные отклонения (СД); разичия считали статистически значимыми при р<0,05. Достоверность признаков с ненормальным распределением устанавливали с помощью U-критерия Манна—Уитни, указывая при этом медиану (M₀), 25-й и 75-й перцентили признаков (Q₁; Q₃); различия считали статистически значимыми при р<0,05. Корреляционные взаимоотношения между ИП клеток и синтезом белка Gli-1 оценивали с помощью коэффициента корреляции Спирмена.

Активная пролиферация клеток считается одной из основных характеристик опухолевого роста. Белок Ki-67 — универсальный маркер пролиферации клеток, так как выявляется в клетке во всех фазах митотического цикла, кроме G₀ [6]. Показано, что в процессе малигнизации происходит увеличение пролиферативной активности эпителиальных клеток всех слоев СОР [4].

В неизмененном эпителии и при ОЭГ пролиферация клеток всегда отмечалась только в ростковом слое (см. рисунок,

Белок Gli-1 синтезируется в цитоплазме эпителиальных клеток, поэтому степень выраженности ИГХ-реакции оценивали по интенсивности окрашивания цитоплазмы клеток СОР.

В неизмененных эпителиальных клетках синтеза белка Gli-1 не отмечалось (см. рисунок, в). При ОЭГ выявлены слабое окрашивание клеток мальпигиевого слоя и отсутствие ИГХ-реакции в шиповатом слое (см. рисунок, е). При SIN в ростковом и шиповатом слоях наблюдалась положительная ИГХ-реакция в цитоплазме клеток (см. рисунок, и). При П.Р. СОР в периферической и центральной зонах отмечалось наиболее выраженное окрашивание цитоплазмы опухолевых клеток (см. рисунок, м). Количественные показатели представлены в таблице.

Как видно из представленных в таблице данных, эффекторный белок Gli-1 сигнального пути SHH в основном синтезируется в ростковом и шиповатом слоях при SIN и периферической и центральной зонах при ПР СОР.

При исследовании корреляционных взаимоотношений в процессе трансформации клеток эпителия СОР в ПР в мальпигиевом слое и периферической зоне, а также шиповатом слое эпителия и центральной зоне установлена достоверная сильная положительная корреляция между пролиферативной активностью клеток по Ki-67 и синтезом белка Gli-1 (r=0,890, p<0,0001).

Учитывая, что в раковых клетках отмечаются процессы самообновления, сходные с таковыми в стволовых клетках, можно предположить, что и механизмы регуляции регенерации этих клеток одинаковы [4]. Изначально активация сигнального пути SHH была выявлена при дифференцировке стволовых клеток и тканевой регенерации. Недавно показано, что он принимает участие и в злокачественной трансформации эпителия при раке поджелудочной железы, раке легкого и раке пищевода [7].

В данном исследовании установлено увеличение концентрации эффекторного белка Gli-1 при SIN и ПР СОР; выявлена также положительная и достоверная корреляционная связь между наличием белка Gli-1 в цитоплазме клеток и их пролиферативной активностью. Таким образом, повышение пролиферации клеток эпителия связано с активацией сигнального пути SHH.

cигнальный путь SHH участвует в регуляции процесса эпителиально-мезенхимальной трансформации, подавляя синтез белка межклеточной адгезии Е-кадгерина, что приводит к появлению в клетках N-кадгерина. Известно, что эпителиально-мезенхимальная трансформация является ключевым моментом инвазивного роста и метастазирования злокачественных опухолей [5, 8]. Поэтому активирование сигнального пути SHH может способствовать инфильтрирующему росту опухолевых клеток, формированию метастазов и неблагоприятному прогнозу [9].

Таким образом, в проведенном исследовании эффекторный белок Gli-1 сигнального пути SHH выявлен в цитоплазме эпителиальных клеток только при SIN и ПР СОР. Обнаружена высокая корреляционная связь между пролиферативной активностью эпителиальных клеток и синтезом белка Gli-1, ввиду чего белок Gli-1 может быть использован в качестве маркера злокачественной трансформации клеток многослойного плоского эпителия СОР на ранних стадиях малигнизации.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Сведения об авторах

*Ивина Анастасия Анатольевна — к.м.н., научный сотрудник отдела общей патологии ФГБУ «ЦНИИС и ЧЛХ» Минздрава России; доцент кафедры патологической анатомии ФГАОУ ВО «Российский университет дружбы народов»