Пациенты с гнойно-воспалительными заболеваниями (ГВЗ) составляют 1/3 всех хирургических больных. Несмотря на достижения в стоматологии и челюстно-лицевой хирургии [1], численность данной категории больных не снижается. Более того, большинство послеоперационных осложнений связано именно с гнойной инфекцией [2]. Это объясняется быстрым увеличением числа штаммов микроорганизмов, устойчивых к воздействию антимикробных препаратов (АМП). При этом количество как антибиотико-чувствительных, так и антибиотико-резистентных штаммов микробов, выделяемых из раневого материала, может быть практически одинаково. Более того, один и тот же вид микроорганизма может быть одновременно и чувствительным, и резистентным к одинаковым препаратам у разных пациентов [3, 4]. Это особенно актуально в стоматологической практике, где ежедневно назначается и используется большое количество АМП.

В патогенезе раневых инфекций определяющую роль играют высоковирулентные микроорганизмы, вызывающие дополнительное повреждение тканей и существенно замедляющие репарацию ран. В настоящее время основными возбудителями ГВЗ считаются стафилококки [5], именно поэтому сравнительные исследования на программно-аппаратном комплексе ИнСпектр М проводилась с использованием этого микроба. Классическим фактором их инвазивности считается гиалуронидаза. Staphylococcus-aureus продуцирует белки, связывающиеся с такими белками, как фибронектин, фибриноген, коллаген, эластин, плазминоген и др. Для стафилококковой инфекции характерны также свойство выделять экзотоксины (стафилогемолизин, стафилолейцин, плазмокоагулаза и др.) и высокая устойчивость к антибиотикам и антисептикам.

Исследование материала, полученного из гнойно-воспалительных очагов челюстно-лицевой области (ЧЛО), и интерпретация результатов исследования относятся к числу наиболее сложных проблем клинической микробиологии, поскольку современные методы таких исследований трудоемки и длительны. Зачастую от момента доставки патологического материала в микробиологическую лабораторию до получения полного ответа проходит 3—5 сут, что не отвечает требованиям клиницистов, особенно в условиях стоматологических поликлиник и челюстно-лицевых стационаров ввиду скоротечности развития гнойно-воспалительного процесса и его жизнеугрожающих осложнений большой пропускной способности и загруженности. Поэтому чаще всего в стоматологической практике антибактериальную терапию начинают с эмпирического подбора препаратов.

Кроме того, зачастую технически трудно в реальном времени установить влияние внутрибольничной инфекции (например, синегнойной палочки) на течение (ГВЗ), что также приводит к неадекватному применению лекарственных средств, поскольку микрофлора патологического очага меняется минимум 2 раза в течение 48 ч.

Кроме микробиологического метода, существуют и другие лабораторные исследования, позволяющие быстро получать объективную информацию о микробном составе исследуемого материала. Это — автоматические системы идентификации бактерий. Они позволяют на 24—48 ч быстрее получить информацию о виде возбудителя заболевания и его чувствительности к АМП. В настоящее время наибольшее распространение получили системы типа Microscan и Vitek. Масс-спектрометры представляют собой вакуумные приборы, определяющие массы атомов (молекул). Их работа основана на физических законах движения заряженных частиц в электрических и магнитных полях. Несмотря на положительные качества этой аппаратуры, она имеет и недостатки: дороговизна, сложность обслуживания, стационарность прибора. Кроме того, они не позволяют определять концентрацию микроорганизмов и их чувствительность к АМП, и, главное, их невозможно применять непосредственно в условии клиники у постели пациента [6, 7]. Все отмеченное препятствует в целом решению проблемы эндогенного инфицирования поврежденной области и генерализации патологического процесса, причем это характерно как для условно-патогенных бактерий, так и для сапрофитов. Особенно это актуально для пациентов с развившимся дисбактериозом на фоне эмпирической антибиотикотерапии. При получении клиницистом результатов данные анализа уже не соответствуют процессам в очаге воспаления. Сохраняется также проблема доставки биоматериала, так как около 30% штаммов бактерий не доходят до лабораторного исследования [8].

Вышесказанное обосновывает необходимость поиска и разработки новых экспресс-методов диагностики. Эти методы должны давать достоверные результаты, быть быстроосуществимыми, соответствовать скорости генерализации патологического процесса, адекватными клинике течения заболевания, прогнозировать процесс реабилитации, оценивать его эффективность и обладать экономической целесообразностью.

Цель нашего исследования — экспериментальное и клинико-бактериологическое обоснование возможности применения лазерной диагностики для идентификации основных возбудителей ГВЗ ЧЛО.

Исходя из технологического принципа раман-люминесцентной спектроскопии (РЛС), налажен выпуск уникального (рис. 1)

Для индикации и идентификации микроорганизмов использовали эффект гигантского рамановского рассеяния (РС) и SERS-подложки с металлическими нано-шариками серебра (разработан физиком В.И. Кукушкиным), повышающий чувствительность в 10⁴—10⁷ раз в зависимости от объекта исследования.

В качестве объектов были взяты контрольные (референтные) штаммы (Pseudomonas aeruginosa 27853 и S. aureus 25923) и клинические культуры Staphylococcus, Bacillus, Escherichia-coli.

Все микроорганизмы выращивали на плотных питательных средах при одинаковых условиях. Для приготовления суспензии использовали суточную агаровую культуру. Исследовали только четко изолированные колонии, выросшие на питательном агаре Мюллер—Хилтона. Суспензии готовились по стандарту McFarland на стерильной дистиллированной воде. Концентрация доводилась до 0,12—0,13 стандарта, что соответствует 1,5·10⁸ КОЕ/мл. Затем производили десятикратные разведения и получали растворы с концентрациями микроорганизмов 1,5·10⁷; 1,5·10⁶; 1,5·10⁵; 1,5·10⁴, которые исследовали раман-флюоресцентным методом. Контрольная пробирка содержала стерильную дистиллированную воду.

На SERS-подложку наносили суспензию капельным методом. Проводили регистрацию спектра. Для получения достоверных и воспроизводимых результатов производилось 2 последовательных измерения. Каждое измерение количественно и качественно представляло усредненную величину 10 последовательных измерений. Параллельно производили высевы суспензии на чашки со специализированной питательной средой и последующей классической бактериологической верификацией микробов.

Среди разнообразных методов экспресс-анализа органических веществ, основанных на химических и физических принципах, можно выделить метод неупругого рассеяния света (рамановский метод). РС света обусловлено неупругими столкновениями световых квантов (фотонов) с атомами исследуемого вещества. Получаемый спектр состоит из линий, соответствующих деформационным и валентным колебаниям химических связей углерода с другими элементами (водородом, кислородом и азотом), а также характеристическим колебаниям различных функциональных групп — гидроксильной -OH, аминогруппы -NH₂ и т. д.). Поскольку в органических молекулах имеется большое количество вращательных и колебательных степеней свободы, все они проявляются в спектре в виде набора линий, каждая из которых характеризуется индивидуальным положением и относительной интенсивностью. Именно этот набор спектральных характеристик дает возможность говорить о рамановском «отпечатке» пальцев органической молекулы, проводить высокочувствительную и точную экспресс-диагностику заболеваний и процессов микробной природы.

На рис. 2—4

Показано, что для бактерии Bacillsus-subtilius индивидуальны рамановские пики на 657, 726, 1248, 1377, 1466, 1617 см^–1; для E. coli — 1140, 1551 см^–1, для S. aureus — 959, 1006, 1160, 1284, 1530 см^–1 , для S. haemolyticus — 1327, 1369, для Ps. aeruginosa — 675, 1353, 1404, 1605, 1630 см^–1. То есть видовые индивидуальные линии рамановского спектра культур различны и являются их своеобразным «паспортом». Установлено также, что спектры разных штаммов различны, но одинаковы в пределах одного вида бактерий (см. рис. 2).

В отдельном эксперименте изучали принципиальную возможность использования экспресс-метода для определения чувствительности микробов к антибактериальным препаратам. При обработке Ps. aeruginosa хлорамином ее специфические амплитудно-спектральные характеристики исчезают, что отличает эти бактерии от контрольных объектов сравнения (водный раствор хлорамина).

Таким образом, данная методика может быть применена и для оценки эффективности дезинфицирующих средств санитарной обработки в медицинских учреждениях, например в стоматологии, отделениях челюстно-лицевой хирургии.

На примере возбудителей ГВЗ нами установлено, что каждый вид бактерий характеризуется индивидуальными спектральными линиями РС, что позволяет идентифицировать их за короткое время (1—2 мин). Предлагаемый способ отличается и высокой чувствительностью (10⁴—10⁶ КОЕ/мл) (рис. 5).

Таким образом, представленные данные убедительно свидетельствуют о преимуществах АПК ИнСпектр М для индикации микробов. Показаны как его высокая аналитическая чувствительность и специфичность, так и его способность измерять концентрации микробов. В литературе приводятся лишь единичные сведения о возможной лабораторной и клинической индикации некоторых видов микроорганизмов методом РЛС, а полученные результаты не объективизированы с позиций чувствительности и специфичности, особенно аналитической, что затрудняет их внедрение в медицинскую практику.

Поэтому нами разработан алгоритм его применения в актуальных областях медицины, особенно при гнойно-воспалительных процессах ЧЛО. Создание библиотеки микроорганизмов ГВЗ ЧЛО и портативность делают возможным использование метода ЛКД для экспресс-индикации гнойных инфекций непосредственно в клинических условиях, т. е. в соответствии с современными принципами ВОЗ «диагностика по месту лечения».

При этом возможны следующие варианты применения комплексов ИнСпектр М и в медико-биологических исследованиях как in-vivo, так и in-vitro:

1. Для идентификации, индикации и дифференциации микроорганизмов, а также для определения чувствительности микробов к антимикробным препаратам и мониторинга плазмы крови. Данные исследования проводятся in-vitro с помощью SERS-подложек на комплексе ИнСпектр М в сочетании с вертикальной насадкой или микроскопом: возможно также сканирование по поверхности исследуемого образца в процессе измерения. Метод гигантского РС на SERS-подложках повышает чувствительность обнаружения и специфичность идентификации некоторых микроорганизмов (например тех, которые содержат пигменты или имеют рамановски-активные продукты жизнедеятельности), по сравнению с таковыми при использовании других экспресс-методов.

2. Для проведения экспресс-диагностики кариеса и флюороза, объективизации их лечения, ускоренного исследования микробной ассоциации, определения относительной величины минерализации твердых тканей зуба. Данные исследования проводятся как in-vitro, так и in-vivo на комплексе ИнСпектр М. При исследовании in-vitro возможно сочетание комплекса ИнСпектр М с любой из прилагающихся насадок и микроскопом. При исследовании in-vivo используется спектрометр с волоконно-оптическим кабелем.

3. Для диагностики и исследования опухолевидных образований как доброкачественных, так и злокачественных, и здоровых тканей in-vivo и in-vitro. При исследовании in-vitro возможно сочетание комплекса ИнСпектр М с любой из прилагающихся насадок и микроскопом. Путем одновременного измерения РС и сигнала флюоресценции на объемном куске исследуемой ткани и на тонком слое жидкой фазы мазка ткани на SERS-подложках записываются спектры доброкачественных, злокачественных и здоровых тканей, анализ которых обнаруживает ряд характерных различий. При исследовании in-vivo используется — оптическим кабелем.

Таким образом, диагностическая и аналитическая надежность, быстрое получение результата, высокие чувствительность и специфичность, экономическая эффективность благодаря отсутствию необходимости использовать питательные среды и осуществлять транспортировку исследуемого субстрата в микробиологические лаборатории позволят клиницистам рассмотреть возможность применения лазерной рамановской диагностики в качестве перспективного универсального экспресс-метода в клинической стоматологической практике.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

*Тел.: +7(916)204-5855