Метаболический синдром (МС) представляет собой симптомокомплекс, включающий абдоминальное ожирение, нарушение толерантности к глюкозе или сахарный диабет 2-го типа, а также характерную для этой патологии атерогенную дислипидемию (ВНОК, 2009). По данным Международной федерации диабета, распространенность МС в популяции около 25%, а среди лиц старше 50 лет она достигает 40—50% (IDF, 2011). Из-за развития тяжелых осложнений мс не только приводит к потере здоровья, снижению качества и продолжительности жизни, но и требует значительных финансовых затрат на лечение и реабилитацию как со стороны государства, так и самого пациента [1, 2, 5]. В свою очередь длительно протекающие воспалительные заболевания пародонта также могут оказывать негативные воздействия на организм в целом [12, 13].

В ряде клинических исследований показано, что у пациентов с МС отмечается более тяжелое течение воспалительных заболеваний пародонта. Полагают, что эти заболевания по принципу суперпозиции оказывают взаимное влияние друг на друга, но точный механизм этой взаимо-связи до конца не выяснен [7, 11].

Установлено, что общими патогенетическими звеньями МС и ХГП являются системное воспаление и оксидативный стресс, которые усугубляются вследствие дисбиоза пищеварительного тракта и сопутствующих заболеваний — гастрита, энтероколита, стеатогепатита, сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ), способствующих увеличению содержания провоспалительных медиаторов и продуктов свободнорадикального окисления в плазме крови [3, 6].

Вместе с тем еще недостаточно данных, позволяющих провести более детальное изучение механизмов развития дисбиотических процессов при ХГП и М.С. Роль дисбиоза пищеварительного тракта в развитии системной патологии и взаимовлияния бактерий из биоценозов разных отделов желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) редко учитываются в клинической практике, что может являться причиной низкой эффективности профилактических и лечебных мероприятий.

Цель исследования — повысить эффективность диагностики и лечения ХГП у пациентов с МС, изучив взаимосвязь микробиоценозов поддесневой биопленки и содержимого кишечника.

Для изучения составов микробных консорциумов рта и кишечника были обследованы 80 человек: 1-я группа — практически здоровые лица с интактным пародонтом (n=40), 2-я группа — пациенты с ХГП на фоне МС (n=40).

Клиническое обследование пациентов включало сбор жалоб и анамнеза, осмотр, определение индекса гигиены ОHI-S (J. Green, J. Vermillion, 1964), индекса кровоточивости Мюллемана (H. Mühlemann, 1971) в модификации Коуэлла (I. Cowell, 1975). Основаниями для постановки диагноза ХГП была совокупность клинических показателей, а также деструкция костной ткани, которую определяли с помощью ортопантомографии.

Отбор образцов поддесневой микрофлоры осуществляли путем введения эндодонтического штифта в пародонтальный карман (ПК) в случае пародонтита или в десневую бороздку в случае здорового пародонта на глубину 2—5 мм. У каждого пациента брали по 4 образца: 2 с верхней челюсти и 2 с нижней (эти образцы от каждого пациента маркировали как, А и В), поскольку развитие пародонтита может быть неравномерным, забор биологического материала из разных точек может дать более полную картину и позволит усреднить результаты в случае их неравномерности. Часто заболевание в первую очередь поражает коренные зубы, поэтому пробы брали из десневой бороздки или ПК в области первых моляров (при их отсутствии в области премоляров).

Для исследования микрофлоры кишечника пациенты сдавали образец кала в стерильном контейнере. Все образцы биоматериала получали индивидуальную маркировку.

Для исследования микрофлоры применяли современные методы молекулярно-генетического исследования:

— полимеразную цепную реакцию (ПЦР) в реальном времени с применением наборов реактивов Дентофлор и Энтерофлор «ДНК-технология», Москва;

— NGS-секвенирование суммарной ДНК с праймерами на область V6 16S рДНК с помощью NGS-секвенатора Illumina MiSeq. Для идентификации микроорганизмов использовали процедуру автоматического поиска Blast по базе данных NCBI GenBank (рис. 1).

Результаты исследования общего количества микрофлоры (бактериальная масса) содержимого ПК и кишечника (кал) у пациентов с МС (группа исследования) и лиц без метаболических нарушений (группа сравнения) вы-явили существование межгрупповых различий. Общая бактериальная масса поддесневой микрофлоры у пациентов группы исследования (индекс массы тела (ИМТ)≥25 кг/м²) составила 10^8,4 КОЕ, микрофлоры кишечника — 10^17,4 КОЕ, что статистически достоверно (р<0,01) отличалось от таковых в контроле (ИМТ<25 кг/м²), где в содержимом ПК бактериальная масса была равна 10^4,5 КОЕ, в кишечнике — 10^14,9 КОЕ.

Высокий коэффициент корреляции (r_{КОЕк—КОЕр}) между показателями общей бактериальной массы кишечника и полости рта (ПР; r_{КОЕк—КОЕр}=0,82; р<0,001)свидетельствовал о наличии тесной взаимосвязи состояния микробиоты ПР с микробиотой нижних отделов пищеварительного тракта (кишечник); табл. 1.

Результаты молекулярной характеристики состава микробных консорциумов пародонта с применением набора Дентофлор («ДНК-технология» Москва) представлены в табл. 2.

Результаты молекулярной характеристики состава микробных консорциумов кишечного содержимого, полученные методом ПЦР в реальном времени с применением наборов Энтерофлор «ДНК-технология», Москва, представлены в табл. 3.

В ходе исследования составов поддесневой и кишечной микрофлоры методом ПЦР в реальном времени в группе лиц с ХГП обнаружены закономерности в представленности молекулярных маркеров, существенно отличающиеся от закономерностей в группе лиц с интактным пародонтом.

В составе поддесневой микрофлоры у пациентов с ХГП наблюдается более высокое содержание 3 пародонтопатогенов: P. gingivalis (p=0,0001), T. forsythia (p=0,0002) и T. denticola (p=0,0012). В среднем различия в степени обсемененности этими бактериями в группах здоровых и больных ХГП на фоне МС составляют: для P. gingivalis — 6,7 цикла (104 раза), для T. forsythia — 4,3 цикла (17 раз), для T. denticola — 2,3 цикла (4,9 раза). Обсемененность A. actinomycetemcomitans, P. intermedia и C. albicans не является существенным фактором патогенеза ХГП, в равной мере встречаясь в обеих выборках (соответственно p=0,56; 0,09 и 0,78) — рис. 2.

В содержимом кишечника (кал) у пациентов с ХГП на фоне МС наблюдается более высокое содержание представителей семейств Enterobacteriaceae (p=0,01) и Eubacteriaceae (p=0,003). В среднем различия в степени обсемененности этими бактериями для групп здоровых и больных пародонтитом составляют для Enterobacteriaceae 2,6 цикла (6 раз), а для Eubacteriaceae 3,9 цикла (15 раз) — рис. 3.

Подробный анализ представленности видов и родов бактерий в поддесневой микрофлоре пациентов с ХГП и лиц со здоровым пародонтом был проведен с применением метода NGS-секвенирования на платформе Illumina.

Сопоставление составов микробиомов пародонта и кишечника позволило установить совпадение 242 (93%) родов из 260, в то время как из 500 видов микроорганизмов совпали только 272. Сходство между анаэробными консорциумами пародонта и кишечника проявляется и в том, что доминирующим видом в обоих случаях является Fusobacterium nucleatum.

Это наблюдение показывает, что прямой обмен микрофлорой между слизистыми разных участков ЖКТ хотя и существует, но не являeтся единственным или даже центральным механизмом стабилизации состава различных микробиоценозов. По-видимому, эту функцию выполняют трофические цепи, симбиотические и антагонистические взаимодействия между анаэробными консорциумами в составе микробиоценоза, которые принципиально сходны в обоих случаях. Сходство между анаэробными консорциумами пародонта и прямой кишки проявляется и в том, что доминирующим видом в обоих случаях является Fusobacterium nucleatum.

Достоверность полученных данных была проверена путем сопоставления родов в составах микробиоценозов пародонта у лиц с интактным пародонтом (1-я группа) и у пациентов с ХГП на фоне МС (2-я группа) с применением параметрического критерия Стьюдента, что подтвердило наличие существенных различий между этими группами (табл. 4).

Подобное сравнение родов с применением параметрического критерия Стьюдента было проведено при анализе состава микробиоценозов кишечника; сравнение также подтвердило наличие существенных различий между группами лиц с интактным пародонтом и пациентов с ХГП в сочетании с МС (табл. 5).

Анализируя данные табл. 4 и 5, необходимо отметить, что на уровне родов бактерий наблюдается повышение доли Brachymonas, Longilinea, Leptotrichia и Streptococcus, причем для последнего рода различия между группами контроля и случая статистически недостоверны, хотя средние величины различаются почти в 4 раза. Удивительно, что все 4 рода относятся к микрофлоре кишечника, а не пародонта, что подтверждает тезис о системном характере взаимосвязи между составом микробиоценозов кишечника и пародонта.

Существенно большее число групп — 20 родов микрофлоры кишечника и 6 родов микрофлоры пародонта были ассоциированы со здоровым пародонтом. Как оказалось, роды Akkermansia, Thalassospira, Oxalobacter, Gracilibacter, Fibrobacter и Howardella представлены в фекалиях лиц со здоровым пародонтом в 200, 105, 88, 51, 27 и 25 раз в большей концентрации, чем в фекалиях пациентов с воспалительными поражениями пародонта и М.С. Бактерии этих родов могут рассматриваться как кандидатные энтеропротекторы системного действия.

Наиболее интересным является обнаружение в кишечнике лиц со здоровым пародонтом повышенной доли бактерий рода Akkermansia (содержит единственный вид Akkermansia muciniphila). С 2013 г. опубликовано более 20 статей, в которых повышенный уровень A. muciniphila в микробиоценозе кишечника ассоциируется с индивидуальной устойчивостью человека к ожирению, диабету 2-го типа и развитию МС при любом типе питания [8]. В экспериментах на мышах и в ходе клинических исследований авторы установили, что повышение доли этой бактерии эффективно предотвращает развитие ожирения и диабета 2-го типа, в том числе при наличии генетической предрасположенности к диабету.

Следующей задачей было сравнение состава и численности бактерий разных видов в поддесневом микробиоценозе у пациентов с интактным пародонтом и ХГП; сравнение также выполнялось с применением параметрического критерия Стьюдента (табл. 6).

Аналогичным способом выполнено сравнение численности бактерий разных видов в микробиоценозах кишечника двух групп: лиц с интактным пародонтом и пациентов с диагнозом «пародонтита» (табл. 7).

Анализируя список видов из микробиоценозов пародонта и кишечника, ассоциированных с тем или иным состоянием пародонта, необходимо отметить, что, как и при анализе родов, в нем резко преобладают виды-протекторы, тогда как видов-патогенов насчитывается только 2: Leptotrichia spp. и Brachymonas spp. Оба они идентифицированы в микробиоме кишечника, но ассоциированы с риском развития пародонтита, хотя степень достоверности этой ассоциации невысока (соответственно t=4,0 и 3,3). Напротив, число видов-протекторов, гиперколонизация которыми ассоциируется с интактным пародонтом, достаточно велико: 39 видов в микробиоме кишечника и 19 в микробиоме пародонта.

Наиболее значимым из обнаруженных микробных маркеров, указывающих на низкий уровень предрасположенности к пародонтиту, оказалась гиперколонизация A. muciniphila (t=133,7 при р=10^–6). Этот результат полностью совпадает с наблюдениями, сделанными при анализе ассоциации по родам, что ожидаемо: в роде Akkermansia в настоящее время присутствует только 1 вид. Имеются данные лабораторных исследований, показывающих способность A. muciniphila непосредственно влиять на снижение холестерина в крови, провоспалительных цитокинов в циркуляции, метаболизм антиоксидантов, поступающих с пищей. В совокупности эти наблюдения позволяют предполагать наличие системных эффектов A. muciniphila на организм в целом, которые обусловливают лучшую или худшую степень защиты пародонта от воспалительных поражений [9].

Описывая состав прочих видов, гиперколонизация которыми ассоциирована с низким риском развития пародонтита, необходимо отметить большое число видов, родственных известным пародонтопатогенам.

Во-первых, удивительным является наблюдение, что гиперколонизация кишечника P. gingivalis (в среднем в 2 раза) и T. denticola (в среднем в 6 раз) не связана с риском развития пародонтита. При этом доля этих бактерий в микробиомах кишечника и пародонта в норме и при патологии сопоставима. Из этого можно заключить, что миграция пародонтопатогенов со слизистой одного биотопа в другой не играет роли в развитии пародонтита. Не исключено, что защитный эффект эктопической инфекции проявляется на уровне индукции специфического иммунитета против пародонтопатогенов. Вырабатывающиеся при этом антитела, включая секреторные антитела класса IgA, могут служить фактором защиты тканей пародонта.

Во-вторых, при анализе потенциальных пародонтопротекторов, населяющих сам пародонт, выявлены близкие таксономические родственники большинства патогенов, описанных S. Socransky и соавт. [14]: A. segnis и A. aphrophilus (родственники A. actinomycetemcomitans), T. vencentii (родственник T. denticola), P. baroniae, P. salivae и Prevotella spp. (родственники P. intermedia), а также C. concisus (родственник C. Jejuni — возбудителя энтероколитов).

В-третьих, отдельную группу протекторов составляют виды бактерий, не способные утилизировать сахара и специализирующиеся на декарбоксилировании многоосновных кислот, образующихся при брожении. К этой категории относятся G. paradiacens, N. subflava, Comamonas spp., S. agalactiae, Bergeyella spp., V. dispar и V. parvula.

В-четвертых, довольно многочисленной группой потенциальных протекторов являются микроорганизмы, по своим физиологическим особенностям не способные выживать в условиях поддесневой биопленки, но заносимые туда с пищей. Наиболее ярким представителем этой группы оказалась сине-зеленая водоросль Thalassospira spp. Сюда же можно отнести Bacillus vedderi. Важной особенностью этих видов для клинической практики являются их заведомая биологическая безопасность и удобство для применения в качестве пробиотиков при терапии и профилактике пародонтита. Напротив, виды бактерий, традиционно использующиеся в качестве пробиотиков, — B. adolescentis и L. lactis, вряд ли можно считать перспективными с точки зрения защиты тканей пародонта ввиду их малочисленности и слабого влияния на развитие пародонтита в естественных условиях.

В-пятых, проведенное исследование показало важность анализа штаммовой гетерогенности известных видов бактерий на предмет ее влияния на состояние организма-хозяина. Наблюдаемая тенденция к острой конкуренции между близкими видами, включающими патогенные и протекторные варианты, позволяет предполагать аналогичное явление и внутри видов. Наиболее важным, с нашей точки зрения, объектом для практического решения этой задачи является род Capnocytophaga, который неоднократно связывался с повышенным риском развития пародонтита, но так и не был внесен в список доказанных пародонтопатогенов. Обнаруженная нами ассоциация вида C. leadbetteri в составе микробиоценоза кишечника с низким риском развития пародонтита свидетельствует о целесообразности более пристального анализа систематических отношений внутри рода Capnocytophaga, который может содержать одновременно и пародонтопротекторы, и опасные для тканей пародонта патогены.

Роль дисбиоза пищеварительного тракта в развитии системной патологии, в том числе и МС, и взаимовлияние бактерий из биоценозов разных отделов ЖКТ редко учитываются в клинической практике, что может являться причиной низкой эффективности профилактических и лечебных мероприятий, возникновения рецидивов и прогрессирования различных заболеваний.

Подробное исследование микрофлоры поддесневой биопленки и кишечника до настоящего времени сдерживалось, поскольку из-за сложного состава микробных консорциумов и присутствия до 80—90% облигатных анаэробов идентифицировать большинство микроорганизмов в лабораторных условиях не удавалось [9]. Таким образом, с разработкой метода NGS-секвенирования и расширением сферы его доступности для практического применения появилась возможность более детально исследовать состав микрофлоры различных биотопов организма, идентифицировать ранее не изученные микроорганизмы в составе микробных сообществ ПР и кишечника.

В нашей работе особое внимание было уделено сопоставлению данных, получаемых на одних и тех же биологических образцах методами NGS-секвенирования и ПЦР в реальном времени, поскольку основным предназначением данных, полученных при использовании NGS-секвенирования на ограниченных выборках, являлось развитие методов рутинной клинической диагностики на основе ПЦР в реальном времени.

При анализе состава поддесневой микрофлоры методом ПЦР в реальном времени у пациентов с ХГП выявлено более высокое содержание в поддесневой биопленке P. gingivalis, T. forsythia и T. denticola. В среднем различия в степени обсемененности этими бактериями для групп здоровых и больных пародонтитом составляют: для P. gingivalis 6,7 цикла (104 раза), для T. forsythia 4,3 цикла (17 раз), для T. denticola 2,3 цикла (4,9 раза). При исследовании микрофлоры кишечника у пациентов с ХГП выявлено повышенное содержание представителей семейств Enterobacteriaceae и Eubacteriaceae. Рзличия в степени обсемененности этими бактериями для групп здоровых и больных пародонтитом составляют: для Enterobacteriaceae 2,6 цикла (6 раз), а для Eubacteriaceae 3,9 цикла (15 раз).

NGS-секвенирование образцов суммарной ДНК поддесневой биопленки и кишечного содержимого позволило добиться разрешения от 91 234 до 213 786 индивидуальных последовательностей на образец. Анализ последовательностей позволил идентифицировать в образцах обоих типов по 260—268 родов и 497—500 видов бактерий.

Сопоставление этих списков позволило установить совпадение 242 (93%) родов из 260, т. е. микробиом пародонта и кишечника во многом сходны между собой.

Сопоставление представленности в микробиоценозах кишечника и пародонта OTU-ранга вида показывает существенно большие различия, чем в случае OTU-ранга рода: из 500 видов совпадают только 272.

Сходство между анаэробными консорциумами пародонта и прямой кишки проявляется и в том, что доминирующим видом в обоих случаях является Fusobacterium nucleatum.

Более того, среди несовпадающих родов преобладают организмы, заведомо не способные выживать во внутренней среде организма человека. По-видимому, они занесены туда с водой или пищей: например, водоросли Leuconostoc и Spirulina, симбионты растений (фитопатогены) Rhizobium, Bradirhizobium, Agrobacterium, представители аэробной микрофлоры Pseudomonas, Burkholderia, Sphingomonas, Pseudoxanthomonas, а также митохондрии животных.

В результате нашего исследования выявлены 6 родов потенциальных пародонтопротекторов и 8 родов потенциальных пародонтопатогенов, имеющих отношение к риску возникновения хронического пародонтита.

У лиц со здоровым пародонтом было впервые выявлено статистически достоверное преобладание в составе консорциума рода Veillonella, который, таким образом, должен рассматриваться в качестве маркера здоровья пародонта. Роды Streptococcus, Bergeyella, Granulicatella, Kingella и Corynebacterium могут рассматриваться в качестве кандидатных пародонтопротекторов.

У больных пародонтитом выявлено статистически достоверное повышение представленности родов Porphy-romonas, Treponema, Synergistes, Tannerella, Filifactor, Rumi-nococcus, Parvimonas, Mycoplasma, из которых только 3 (Porphyromonas, Treponema и Tannerella) традиционно рассматриваются как пародонтопатогены.

В результате исследования составов микробных консорциумов ПР и кишечника с применением глубокого секвенирования библиотек 16S рДНК показано, что качественный состав микробиома кишечника пациентов с ХГП достоверно отличается от микробиома пациентов со здоровым пародонтом. Для пациентов с пародонтитом характерно уменьшение в среднем в 16 раз содержания в кишечнике бактерии—протектора A. muciniphila. Наблюдаемый у пациентов с пародонтитом дисбиоз кишечника в большей мере проявляется сокращением представленности в консорциуме протекторной микрофлоры (36 видов), чем увеличением доли патогенов (2 вида).

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.