Данные об изменении состава транскриптома поверхности пародонта в норме и при обострении пародонтита, отражающие ход и исход защитных реакций на бактериальную инфекцию, достаточно многочисленны. Однако недостатком опубликованных работ является практически полное игнорирование скорости изменения состава транскриптома. Несмотря на большое число исследований, посвященных изучению молекулярных маркеров пародонтита, молекулярная диагностика пока не нашла применения в пародонтологической практике. Вместе с тем актуальность использования молекулярных методов в оценке состояния пародонтита неоспорима.

Основную причину возникновения пародонтита большинство авторов рассматривают в инфицировании поверхности тканей пародонта патогенными бактериями [1, 4, 5, 7]. К группе истинных пародонтопатогенов относят такие бактерии, как Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Porphyromonasgingivalis, Prevotellaintermedia, Tannerellaforsythensis, Treponemadenticola[6, 9, 11, 17]. Несмотря на доказанную роль пародонтопатогенных бактерий в этиопатогенезе хронического генерализованного пародонтита (ХГП), молекулярный механизм разрушения пародонтальной связки остается неизвестным [12], а именно до конца не выяснен вклад протеолитической деятельности бактериальных ферментов и матриксных металлопротеиназ (ММП) человека в этот процесс [13, 16].

В обзоре V. Dosseva-Panova и соавт. [10] приводятся данные о влиянии бактериальной обсемененности пародонта на динамику развития ХГП, а также на уровень накопления в пародонте факторов воспаления. Хотя пародонтит рассматривается в качестве типичного многофакторного заболевания, авторы констатируют высокую степень корреляции между степенью поражения пародонта и его обсемененностью грамотрицательными бактериями P. gingivalis, T. forsythensis и T. denticola.

При рассмотрении аутопротеолитической природы деградации соединительнотканного матрикса пародонта неизученным остается вопрос о регуляторном механизме повышения активности собственных ММП [2, 15]. Важной генетической детерминантой, ответственной за повышенный риск возникновения ХГП, в настоящее время считается полиморфизм гена MMП9 (желатиназы) в промоторной области, который приводит к аномальной гиперпродукции MMП9, вызывающей ускоренную деградацию коллагена пародонтальной связки [3, 14].

Изучен ряд других генов, таких как ген интерлейкина (ИЛ)-8, фактора некроза опухоли (ФНО)-α, аллельное состояние которых может влиять на вероятность развития пародонтита, а также на скорость прогрессии и тяжесть заболевания, но результаты проведенных исследований крайне противоречивы [8].

В связи с этим крайне актуальны проблема поиска прогностически значимых генетических маркеров предрасположенности к пародонтиту, а также разработка диагностических тест-систем для определения соответствующих транскриптов на фоне конкретного бактериального биоценоза. Решение этой задачи может внести важнейший вклад в создание концепции, описывающей развитие пародонтита, и обеспечить основу для назначения этиотропных средств его лечения.

Цель работы — выявление взаимосвязи молекулярно-генетических маркеров с клиническими признаками и факторами риска развития хронического пародонтита.

Клинический материал был собран в отделении терапевтической стоматологии Центрального НИИ стоматологии и челюстно-лицевой хирургии. Молекулярно-генетические исследования проводили на базе Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН.

В исследование были включены 288 пациентов без тяжелой соматической патологии в возрасте от 21 года до 63 лет, в том числе 126 мужчин и 162 женщины. У 204 пациентов был ХГП (основная группа), у 84 патология пародонта отсутствовала (контрольная группа). По степени тяжести заболевания пациенты с ХГП распределялись так: ХГП легкой степени — у 42, средней степени — у 108, тяжелой степени — у 54.

Диагноз ХГП ставили исходя из жалоб пациентов на кровоточивость десен, неприятный запах изо рта, подвижность зубов и др., а также из анамнеза и данных клинического обследования. Степень тяжести пародонтита устанавливали на основании глубины пародонтальных карманов (ПК) и степени деструкции костной ткани.

Всем лицам, включенным в исследование, были проведены клиническое стоматологическое обследование, рентгенологическое исследование (ортопантомография — ОПМГ), молекулярно-генетическое исследование на наличие в содержимом ПК/десневой жидкости 5 ДНК-маркеров пародонтопатогенов и 4 РНК-маркеров ИЛ-8, ФНО-α, ММП8, MМП9.

При сборе анамнеза особое внимание уделяли наличию или отсутствию наследственной отягощенности по заболеваниям пародонта со стороны отца и матери. При наличии сопутствующей соматической патологии оценивали ее возможное влияние на состояние тканей пародонта. Выясняли наличие у пациентов вредных привычек, таких как табакокурение. Определяли уровень гигиенических навыков, систематичность и качество выполнения гигиенических процедур по уходу за полостью рта. У пациентов с ХГП оценивали характер проведенного ранее лечения и его эффективность, число ежегодных обострений.

Для уточнения диагноза и оценки состояния костных структур тканей пародонта использовали цифровую ОПМГ.

Всем пациентам заранее сообщали об условиях забора биоматериала. За 30 мин до процедуры рекомендовали воздержаться от чистки зубов, приема пищи и каких-либо жидкостей.

У каждого пациента с ХГП отбирали по 4 образца содержимого ПК для исследования на предмет представленности 5 пародонтопатогенных бактерий (A. actinomycetemcomitans, P. gingivalis, P. intermedia, T. denticola, T. forsythensis) и определения общей бактериальной массы с помощью набора «Дентофлор». Содержимое П.К. извлекали из наиболее глубоких участков с помощью стерильных бумажных эндодонтических штифтов. Тем же методом у каждого пациента отбирали по 2 образца поддесневого содержимого для последующего выделения мРНК и определения уровня транскриптов ФНО-α, MMП8, MMП9, ИЛ-8. У здоровых лиц брали для исследования десневую жидкость, которую получали аналогичным образом.

Штифты с образцами биоматериала немедленно помещали в стерильные пробирки типа Эппендорф объемом 1,5 мл с добавлением специальных сред. Все пробирки маркировали с помощью цифровых кодов, которые регистрировали в индивидуальной карте пациента. Образцы хранили в холодильнике при температуре – 2 °C, а транспортировка в лабораторию осуществлялась в специальных термоконтейнерах при температуре 4 °C.

Для сравнительного анализа достоверности различий выборок по выбранным критериям применяли методы непараметрической статистики Краскела—Уоллиса и Манна—Уитни.

При сравнении степени колонизации поддесневого пространства пародонтопатогенами в зависимости от степени тяжести пародонтита с помощью критерия Краскела—Уоллиса выявлены существенные корреляции для всех видов инфекционных агентов, за исключением A. actinomycetemcomitans (рис. 1).

Наиболее опасным патогеном, уровень представленности которого в общей бактериальной массе значительно нарастал с утяжелением воспалительно-деструктивного процесса в тканях пародонта, оказалась P. gingivalis (p=0,00004), затем следовали участники красного комплекса T. forsythensis (p=0,00009) и T. denticola(p=0,0001), а замыкал ряд вид P. intermedia(p=0,004). Колонизация A. actinomycetemcomitans оказалась полностью независимой от степени тяжести заболевания.

Оценка представленности специфических транскриптов генов при разделении общей выборки на группы по степени тяжести заболевания показала, что уровни транскриптов генов ИЛ-8, ФНО-α, ММП8, ММП9 практически не зависели от степени тяжести ХГП (рис. 2).

Установлено наличие достоверной разницы по маркеру ИЛ-8 при сравнении с помощью критерия Краскела—Уоллиса групп здоровых лиц и пациентов с ХГП легкой степени: соответственно 36,1 и 39,0 цикла. При этом у пациентов со средней и тяжелой степенью ХГП количество транскриптов гена ИЛ-8 оказалось ниже, чем у здоровых лиц: соответственно 34,9 и 33,5 цикла.

С помощью критерия Краскела—Уоллиса установлено, что уровень колонизации поддесневого пространства всеми патогенами, кроме A. actinomycetemcomitans, существенно зависел от глубины ПК, прогрессивно нарастая при увеличении деструкции пародонтального прикрепления. Особенно значимые различия степени колонизации ПК от их глубины выявлены для P. gingivalis(рис. 3).

Оценка представленности транскриптов генов ИЛ-8, ФНО-α, ММП8, ММП9 при разделении общей выборки на группы по глубине ПК дала результаты, практически идентичные тем, что были получены при разделении пациентов по степени тяжести ХГП. Вместе с тем было обнаружено увеличение представленности транскрипта ИЛ-8 по мере увеличения глубины ПК (соответственно 35,5, 34,7 и 27,2 цикла) против 36,4 цикла у здоровых лиц (рис. 4). При этом нарастал разброс показателей содержания транскриптов гена ИЛ-8 внутри групп. Так, среднеквадратичное отклонение в группе здоровых лиц, не имеющих ПК, составило 3,1 цикла, при глубине ПК до 3 мм — 4,3 цикла, при глубине ПК 3—6 мм — 4,5 цикла, при глубине ПК >6 мм — 5,3 цикла.

Анализ представленности бактериальной обсемененности у пациентов с гноетечением и без него не позволил связать этот клинический признак с каким-либо конкретным видом пародонтопатогенов.

В то же время при анализе выборок пациентов с гноетечением и без гноетечения с помощью критерия Манна—Уитни выявлена достоверная разница в содержании мРНК ИЛ-8: значения Сt составили соответственно 35,98 и 30,8 цикла. При переводе этих показателей в линейную шкалу различия между группами составили >30 раз. Это позволяет предположить, что при анализе транскриптома содержимого ПК мРНК ИЛ-8 должна рассматриваться в качестве маркера нейтрофилов, инфильтрированных на поверхности тканей пародонта (табл. 1).

При разделении выборки пациентов по наличию кровоточивости десны, определяемой с помощью индекса Мюллемана, обнаружена положительная корреляция этого симптоматического признака с гиперколонизацией пародонта P. gingivalis, P. intermedia и T. denticola(табл. 2). Лишь между гиперколонизацией тканей пародонта T. forsythensis и наличием кровоточивости десны ассоциации не выявлено.

По данным статистического анализа, наличие кровоточивости не было связано с количеством транскриптов генов ФНО-α, MMП8, MMП9 и ИЛ-8 и геномной ДНК человека. Например, сравнение представленности в поддесневом содержимом транскриптов гена ИЛ-8 показало практически полное отсутствие различий при разделении пациентов на группы по степени кровоточивости: 36,25 и 34,51 цикла при величине среднеквадратичного отклонения 3,39 и 4,47 цикла (р=0,346081).

При анализе выборки пациентов с патологической подвижностью зубов выявлена положительная корреляция этого симптоматического признака с гиперколонизацией пародонта P. intermedia и T. forsythensis(табл. 3). Это наблюдение позволяет предположить, что в персистенции P. intermedia и T. forsythensis существенную роль играет механический фактор, обеспечивающий достаточное поддесневое пространство для размножения этих бактерий.

Как оказалось, патологическая подвижность зубов не ассоциирована с количеством транскриптов генов ФНО-α, MMП8, MMП9 и ИЛ-8 и геномной ДНК человека. Вместе с тем при анализе представленности транскрипта гена ИЛ-8 обнаружены некоторые различия при разделении пациентов на группы по степени подвижности зубов. Значения Сt составили 36,07 у здоровых лиц против 32,49 у пациентов с выраженностью этого признака, но различия не были значимыми (0,245004). Необходимо отметить, что подвижность зубов коррелировала с 2 другими клиническими признаками: наличием поддесневых зубных отложений (индекс гигиены Green—Vermillion) и кровоточивостью десны (индекс Muhlemann), что вполне объяснимо с точки зрения патофизиологии пародонтита.

Таким образом, данные клинических и лабораторных исследований с последующей их статистической обработкой позволяют заключить, что:

— существует достоверная разница в содержании мРНК ИЛ-8 у пациентов с гноетечением, однако анализ представленности бактерий в поддесневой биопленке у пациентов с гноетечением не позволяет связать этот симптом с каким-либо конкретным видом пародонтопатогенов;

— обнаружена положительная корреляция патологической подвижности зубов с гиперколонизацией пародонта P. intermedia и T. forsythensis;

— выявлена положительная корреляция кровоточивости десен с гиперколонизацией пародонта P. gingivalis, P. intermedia и T. denticola, в то время как гиперколонизация пародонта T. forsythensis с этим признаком не ассоциирована;

— обнаружены корреляции между потерей зубов и гиперколонизацией патогенами P. gingivalis, T. forsythensis и T. denticola; у пациентов с частичной адентией наблюдается также повышение локального уровня мРНК ИЛ-8;

— установлено существенное превышение колонизации P. gingivalis и P. intermedia у пациентов с неблагоприятной наследственностью по материнской линии, а при наличии генетической отягощенности одновременно по материнской и отцовской линии — гиперколонизация P. gingivalis и повышение уровня мРНК ИЛ-8.