Влияние октакальциевого фосфата на динамику формирования костного матрикса в экспериментально воспроизведенных костных дефектах

Разработка новых материалов для замещения костных дефектов — одно из актуальных направлений хирургической стоматологии и имплантологии. Основная задача заключается не в простом заполнении объема костного дефекта пластическим материалом, а в возможности активного включения последнего в активный жизненный цикл реципиентных тканей, в частности костных структур.

В настоящее время в литературе появилось большое число сообщений о разработке новых остеопластических материалов и эффективности их применения, сообщений часто поспешных и недостаточно обоснованных в плане репрезентативности отдаленных сроков исследований, что, несомненно, вносит хаос в представления об истинном состоянии дел, препятствует объективной оценке положительных и отрицательных свойств предлагаемых и порой широко рекламируемых биоматериалов. В большинстве своем все доступные на сегодняшний день синтетические биоматериалы являются остеокондукторами, которые представляют собой биологически инертные матриксы.

Биоинженерные конструкции (с использованием морфогенетических белков) дороги, иногда их цена в несколько раз превышает стоимость самой операции.

Из образцов кальцийфосфатной керамики сегодня отдают предпочтение метастабильным формам. К ним можно отнести октакальцийфосфат (ОКФ), которому уделяется особое внимание как в нашей стране [1, 2, 10, 21], так и за рубежом [17, 18].

В тканевой среде ОКФ более растворим и менее стабилен, чем синтетический гидроксиапатит (ГА). ОКФ обладает слоистой структурой из перемежающихся гидратированных и апатитных слоев.

Гидролиз ОКФ в ГА — процесс термодинамически выгодный, происходит спонтанно и необратимо. С этим связано то, что ОКФ является предшественником (метастабильной фазой) минерализации биологических апатитов, так как он — центр кристаллизации минеральной фракции кости и зубов.

Трансформация ОКФ в ГА — один из факторов, стимулирующих дифференциацию остеобластных клеток [3, 9, 14, 16].

На остеоиндуктивные свойства ОКФ указывали ряд авторов [4, 5, 7, 10, 13, 18]. Исследования invivo показали, что синтетический ОКФ в мышечных (S. Ban и соавт., 1992), подкожных [20] тканях и на различных костных участках [10, 19, 20] превращается в биологический апатит. Также было показано, что вслед за резорбцией ОКФ происходит его замещение новой костью [8, 10]. Кроме того, было обнаружено, что покрытие ОКФ на дентальных имплантатах способствует активной остеоинтеграции [4, 5], стимулирует пролиферацию остеобластных клеток [6], а в ряде случаев способствует эктопическому остеогенезу [7, 21].

В данной работе проведено исследование влияния остеопластического материала на основе ОКФ на кинетические особенности новообразования костного матрикса (КМ) в экспериментально воспроизведенных костных дефектах.

Работа проведена на экспериментальной модели, предложенной L. Le Guehennec и соавт. (2005), — критический дефект в области эпифиза бедренной кости крыс линии Вистар. Данная модель использовалась также в работах R. Muzzarelli и соавт. (1993). Согласно этой модели, воспроизводили дефект в области эпифиза бедренной кости крыс линии Вистар массой 230—250 г.

В настоящей работе применен ОКФ, разработанный совместно Центральным НИИ стоматологии и Институтом металлургии и материаловедения им. А.А. Байкова РАН. Размеры гранул ОКФ составляли 300—400 мкм. Для определения плотности костного вещества были сформированы две группы:

1-я группа — зрелая кость, которую использовали для статистического анализа при оценке плотности кости; 2-я группа — костное вещество в области расположения гранул ОКФ.

Методика экспериментальной операции. Под ксилазиновым наркозом производили линейный разрез с медиальной стороны эпифиза бедренной кости. Тупым путем отслаивали мягкие ткани. С помощью стоматологической портативной машины на малых оборотах (600 об/мин) с водяным охлаждением создавали искусственный дырчатый дефект, диаметром 2—3 мм и длиной 3—4 мм. В дефект вводили исследуемый материал, ОКФ навеской 3,5—3,8 мг. Операционную рану ушивали послойно кетгутом. Проводили антисептическую обработку.

Сканирующая электронная микроскопия (СЭМ). Объекты исследования фиксировали на предметных столиках и помещали в вакуумную камеру прибора EIKO IB-3 Ion Coater для обезвоживания. Объекты подвергали металлизации с помощью золотопалладиевого покрытия в аппарате производства «Hitachi» (Япония) марки HCP-1. Исследование проводили на сканирующем электронном микроскопе CamScanS-2.

Гистологическая обработка материала. После выведения животных из эксперимента выделяли макропрепараты оперированных конечностей, фиксировали их в 10% нейтральном формалине, декальцинировали в трилоне-Б, обезвоживали, заливали в парафин, готовили серийные срезы толщиной 5—6 мкм и окрашивали гематоксилином и эозином (Г-Э). Гистологические препараты изучали в проходящем свете на микроскопе AxioSkop 40 («Carl Zeiss», Германия).

Расчет плотности кости на гистограммах. Плотность новообразованных костных структур оценивали следующим образом. Подсчет производили при пороге (threshold) 150 в программе Adobe Photoshop на гистомикрофотограммах (X40) в центральном участке костного дефекта после выделения соответствующих областей (новая кость, соединительная ткань, остаточный биоматериал). Пиксели переводили в черно-белый режим без градиента серого. Пиксели черного цвета соответствовали костному веществу, белые пиксели костных структур не содержали. Производили подсчет количества черных пикселей. Результат делили на общую площадь гистомикрофотограммы и получали усредненную величину плотности. При статистической обработке полученных данных применяли методы непараметрического анализа с апостериорным сравнением средних по критерию Тьюки.

Сроки эксперимента — 1 и 2 мес, в эксперимент включили 15 крыс. Контрольная группа 1 — зрелая интактная кость (3 животных); контрольная группа 2 — зрелая интактная кость (6 животных) — заживление раны под кровяным сгустком; 6 животным имплантировали синтетические гранулы ОКФ (основная группа).

СЭМ. Гранулы ОКФ круглой или овальной формы с пористо-ячеистой структурой поверхности (рис. 1). ОКФ расположен между слоями в ГА, что согласуется с данными литературы (W. Brown и соавт., 1962 а, б), где ОКФ ориентирован по плоскостям {100}.

Особенностью ОКФ (при рентгенофазовом анализе) является характерный пик при 4,8°C, что отличает его от ГА [10].

Контрольная группа 1 (нативная зрелая кость). В гистопрепаратах определялся фрагмент зрелой, частью — компактной, частью — губчатой костной ткани с хорошо выраженными остеонными системами.

Контрольная группа 2 (заживление костного дефекта под кровяным сгустком). В гистологических препаратах обнаруживался полый костный дефект с единичными костными фрагментами, выступающими в его просвет. Дефект заполняла рыхлая, богатая сосудами капиллярного типа, соединительная ткань, местами инфильтрированная лимфомакрофагальными элементами.

Основная группа. В исследованных гистологических препаратах со сроками наблюдений 1 и 2 мес в области входа в дефект кости обнаруживались гранулы ОКФ, образующие пакеты, состоящие из разной формы слабоокрашенных телец с неровными, часто фестончатыми краями, имеющих вид, образно говоря, «колеса» с радиально располагающимися «спицами». Вокруг описанных блоков из гранул материала определялась тонкая фиброзная пластинка из пучков коллагеновых фибрилл (рис. 2,). В прилежащей костной стенке были видны многочисленные линии склеивания.

Уже в начале костного дефекта наблюдалось скопление имплантированного материала, окруженного соединительнотканной капсулой, прилегающей к костной ткани. Соединительнотканная компонента, содержащая гранулы ОКФ, отличалась неоднородностью. Одна часть, обращенная к центру дефекта, имела плотный фиброзный характер с небольшим количеством клеточных элементов, другая, обращенная ко входу, имела нежный соединительнотканный матрикс с обилием клеточных элементов (рис. 3,).

В центральной области дефекта картина менялась. Там, где ОКФ вступал в контакт с костью, исчезала фиброзная капсула, происходила резорбция ОКФ. Вокруг гранул ОКФ наблюдалось отложение оксифильного ретикулофиброзного костного вещества (рис. 4,). Как правило, в таких случаях оксифильное костное вещество откладывалось непосредственно на гранулах ОКФ, представляющих собой слабовосприимчивую к гистологическим красителям субстанцию, что сложно было наблюдать на ранней стадии формирования К.М. Местами в непосредственной близости от описанных отложений костного вещества можно было видеть мельчайшие капиллярные сосуды.

Наблюдалось постепенное рассасывание гранулы ОКФ, что приводило к ее уменьшению в размерах и визуальному увеличению общей массы новообразованного костного вещества; это наглядно прослеживалось при сопоставлении гистологических картин 1-го и 2-го месяца наблюдений (рис. 5, 6,) и отражено на рис. 7.

Подобные результаты были получены при подсадке ОКФ под капсулу почки мышам; размер гранул уменьшался примерно в 2 раза через 4 мес [10]. При помещении блоков ОКФ (в формате 3D) в критические дефекты черепа кролика размер блоков уменьшался в 2,5 раза через 6 мес и они замещались новообразованной костной тканью, что говорит о пластичности данного материала [11].

Статистический анализ показал, что через 1 мес эксперимента плотность кости возрастала (40,3±3,8) по сравнению с таковой у животных, у которых заживление костного дефекта происходило под кровяным сгустком (9,1±3,2), и увеличивалась к 2 мес: соответственно 60,2±4,9 и 15,2±4,8 (см. рис. 6).

Таким образом, гистоморфологическое исследование тканевого материала и структуры минеральных включений выявило структурную гетерогенность минеральных включений первично однородного ОКФ, что явилось результатом биологически детерминированных процессов, протекающих in vivo в течение 1 и 2 мес эксперимента, и заключающихся в:

— осаждении кристаллов ГА на ОКФ, который является метастабильной фазой, инициирующей процесс остеогенеза;

— воздействии ОКФ на костеобразование как активного остеоиндуктора, т. е. ОКФ обладает высоким остеоиндуктивным потенциалом.

Работа выполнена в рамках Программы Президиума РАН №1. П20.