Тканевая инженерия в стоматологии

Изучение стволовых клеток (СК) и успехи в области клеточной и молекулярной биологии создают условия для развития новой стратегии терапии — регенерации тканей, поврежденных в результате травмы или заболеваний, и формирования нового раздела медицины — регенеративной стоматологии. Тканевая инженерия основана на принципах идентификации клеток с последующим культивированием, результатах изучения механизмов, инициирующих дифференцировку клеток. В последние годы рассматривается применение СК, тканевой инженерии для регенерации костных дефектов челюстей, тканей зуба и пародонта.

СК — недифференцированные и неспецифичные предшественники клеток организма, способные к самообновлению и дифференцированию в клетки разных типов под воздействием компонентов микроокружения. К компонентам микроокружения СК относят факторы роста и транскрипции, морфогенетические факторы, рецепторы клеток, сигнальные молекулы, матрицу.

Факторы роста — внеклеточные белки, которые связываются с рецепторами клеток и регулируют клеточную активность: адгезию, пролиферацию, миграцию и дифференцировку. Применение факторов роста и химических соединений (дексаметазона, β-глицерофосфата, аскорбиновой кислоты и витамина D) необходимо для индукции остеогенной дифференцировки СК invitro [9].

По происхождению СК делятся на эктодермальные (ЭСК) и мезенхимальные (МСК). Ниши ЭСК тканей зуба впервые обнаружены при культивировании клеток эмали резцов мыши. ЭСК зуба способны дифференцироваться в амелобласты и непрерывно продуцировать эмаль. Обнаруженные клетки специфичны только для грызунов. Поврежденную эмаль человека невозможно восстановить, так как она не содержит клеток.

МСК впервые обнаружили в костном мозге, позднее их изолировали из мышечной ткани, кожи, жировой ткани и тканей орофациальной области. Критериями для выявления MSC являются пластичность клеток при культивировании и мультипотентность. Популяция представлена клетками с фенотипами CD105⁺, CD73⁺, CD90⁺ и CD45^–, CD34^–, CD14^–, CD19^– [9]. При регенерации тканей челюстно-лицевой области выделяют МСК нескольких типов из различных источников.

СК костного мозга (BMSC) — мультипотентные ASC, обладающие высокой способностью к дифференцировке в остеобласты, хондроциты, липоциты, благодаря чему их применяют для регенерации костной ткани [5]. В этой популяции преобладают CD73⁺-, CD90⁺-, CD105⁺-, CD14^–-, CD34^–-, CD45^–-, CD79^–-, CD19^–-,HLA II^–-клетки [9]. BMSC способны образовывать цемент зуба и альвеолы челюстей invivo.

СК жировой ткани (ADSC) получают при липэктомии в разных участках тела. В популяции преобладают CD29⁺-, CD44⁺-, CD71⁺-, CD90⁺-, CD105⁺-, CD106⁺-, CD166⁺-клетки [9]. ADSC способны дифференцироваться в клетки костной, хрящевой, жировой, мышечной и нервной ткани. Клетки представляют собой альтернативу BMSC при регенерации костной ткани орофациальной области [1, 9].

Нанесение ADSC на поверхность титанового имплантата ускоряет процессы остеоинтеграции по сравнению с таковыми у имплантатов без СК или с нежизнеспособными СК при отсроченной имплантации [3]. Кроме того, для образования костной ткани используют пористую кальцийфосфатную керамику и ADSC, что стимулирует остеокондукцию и остеоиндукцию invivo [17].

Тканеинженерную конструкцию на основе ADSC применяют для восстановления костных дефектов верхней челюсти (ВЧ), лунок удаленных зубов, что позволяет предотвратить резорбцию кости, воссоздать ее объем [1, 4, 19].

Особый интерес представляет использование для лечебных целей СК, предварительно культивированных на матрице. Матрица — физико-химическая и биологическая среда, необходимая для усиления пролиферации и дифференцировки клеток invitro и увеличения поверхности новой ткани invivo. В качестве матриц могут быть использованы биоматериалы (коллаген, минерализованный гидроксиапатит, трикальция фосфат, фибрин), синтетические полимерные материалы (PLGA, polyethylene glycol, PCL, alumina, производные углеродных соединений, композиты), металлы и их сплавы, керамика [2, 3, 17, 23]. В качестве носителя применяют имплантаты из биоинертных материалов, чаще всего из титана [18]. MSC придают остеоиндуктивные свойства материалам, которые в обычных условиях ими не обладают [2, 3].

Замещение дефектов челюстей и свода черепа. Наибольшая эффективность регенерации костной ткани достигается при использовании СК и технологий тканевой инженерии. Результат регенерации костной ткани с использованием BMSC и матрицы сопоставим с эффективностью регенерации при использовании аутологичной костной ткани подвздошного гребня. Кроме того, эффективность регенерации повышается при использовании факторов роста.

Применение фасциального лоскута с BMSC, BMP2, основного фактора роста фибробластов (bFGF) на желатиновой матрице для регенерации костной ткани способствует формированию более плотного костного минерализованного матрикса, чем при использовании других веществ [4]. Использование BMSC, матрицы PLGA/PCL/nHA, сосудистого стента при совместном применении молекул BMP2 и bFGF усиливает остеогенез и степень васкуляризации в области дефекта нижней челюсти по сравнению с таковыми при раздельном применении этих техник [24].

Резорбция ВЧ после потери зубов делает необходимой пластику ее альвеолярной части. Замещение дефектов на модели кроликов с использованием тканеинженерной кости, BMP2, кальцийфосфатной матрицы и BMSC позволяет устранить данный дефект.

G. Chai и соавт. в 2006 г. [6] для реконструкции альвеолярной кости и лечения расщелин твердого неба использовали BMSC и деминерализованный аллогенный костный матрикс.

Восстановить дефекты челюстей можно аллогенной костной тканью [7], но в таких случаях необходимо использование остеокондукторов и остеоиндукторов. Главные недостатки аллогенной трансплантации — возможность передачи вирусных заболеваний, иммунологический ответ, ограниченное количество донорского материала.

Особого внимания заслуживает проблема замещения костных дефектов свода черепа. Эти кости характеризуются низкой способностью к восстановлению, поэтому при их обширных повреждениях возникает необходимость использования различных материалов. Применение BMSC, BMP2 и коллагена I типа способствует более быстрой регенерации критического дефекта краниофациальной области. Прочность образованной костной ткани сопоставима с таковой в нормальных участках [7].

В эксперименте на мышах показано эффективное использование матрицы (сополимер молочной и гликолевой кислот) и ADSC благодаря способности ADSC к дифференцировке в остеобласты, что приводило к закрытию дефекта свода черепа [8]. Позже установлено, что предварительное культивирование ADSC в остеогенном направлении на матрице до трансплантации в костный дефект значительно повышает степень регенерации дефекта свода черепа [24]. F. Pieri и соавт. [19] в 2010 г. показали, что трансплантация аутологичных ADSC со скаффолдом бычьей кости (Bio-Oss) способствовала формированию костной ткани и вертикальному росту костей свода черепа кроликов. Предполагается, что ADSC способствуют вертикальному росту и альвеолярной кости.

Дефекты костей свода черепа замещают также, сочетая ADSC и биоинженерные конструкции на основе пористого политетрафторэтилена с наноструктурированным нерезорбируемым покрытием, что способствует образованию костного регенерата [2]. Однако в эксперименте на кроликах минерализация дефекта костной ткани была более значительной при использовании культуры BMSC, чем ADSC [19].

В последние годы большой интерес вызывает регенерация тканей зуба, а также тканей пародонта. Это стало возможным благодаря получению в орофациальной области СК, обладающих разной дифференциальной активностью.

При формировании структур зуба происходит взаимодействие между ЭСК и MSC. Молекулы bFGF регулируют расположение зачатков, стадии инициации, инвагинации и дифференцировки. Морфогенез зуба регулируется также молекулярными сигналами мезенхимы. Факторы транскрипции Msx1 и Osr2 действуют как антагонисты в регуляции уровня и пространственного распределения BMP4. Так, у мышей, лишенных Osr2, закладываются сверхкомплектные зубы лингвальнее от моляров. Osr2 ограничивает степень экспрессии BMP4, в то время как Msx1 восстанавливает. Дисбаланс этих молекул приводит к отсутствию зубов или к закладке сверхкомплектных [25].

СК пульпы зуба (DPSC). Потенциальным источником MSC с высокой клоногенной и пролиферативной активностью является пульпа зуба. DPSC способны формировать минерализированные ткани как in vitro, так и in vivo [10]. DPSC изолируют из пульпы третьего моляра путем ферментативного расщепления тканей пульпы или при пульпэктомии [15]. DPSC способны к дифференцировке в остеогенные, одонтогенные, нейрогенные, липогенные линии invitro [10]. В ткани пульпы выявлены клетки с фенотипами STRO-1⁺, CD9⁺, CD10⁺, CD13⁺, CD24⁺, CD29⁺, CD44⁺, CD59⁺, CD73⁺, CD90⁺, CD105⁺, CD106⁺, CD146⁺, CD166⁺, HLA I⁺, CD14^–, CD31^–, CD34^–, CD45^–, CD71^–, HLAII^–. Эти клетки характеризуются высоким содержанием щелочной фосфатазы, они экспрессируют маркеры к остеонектину, остеокальцину, секреторному фосфопротеину [10, 15], способны дифференцироваться в остеоциты и формировать компактную кость in vivo. Скорость пролиферации DPSC выше, чем у BMSC.

S. Liu и соавт. [13] в 2004 г. обнаружили, что клетки корневой пульпы имеют бо́льшую способность к минерализации, чем коронковой. Пролиферативные способности клеток коронковой и корневой пульпы схожи. Плотность DPSC в корне выше, чем в коронке. Культивирование DPSC на scaffold-матрице с DMP-1, TGF-1, FGF-2, BMP2 способствует одонтогенному потенциалу дифференцировки invivo. При этом формируется дентино-пульпарный комплекс, окруженный одонтобластоподобными клетками, продуцирующими дентин [12].

СК пульпы молочного зуба (SHED). В 2003 г. M. Miura и соавт. [20] обнаружили MSC-подобные клетки в пульпе молочного зуба с высокой пролиферативной способностью. SHED относятся к мультипотентным клеткам, способным к самовосстановлению [21]. Эти клетки не образуют дентино-пульпарного комплекса в отличие от DPSC. В популяции выявлены STRO-1⁺-, CD146⁺-клетки с высокой скоростью пролиферации. Кроме того, эти клетки экспрессируют маркеры ESC (Oct-4, Nanog, ssea-3, ssea-4, Tra-1−60, TRA-1−81, SOX-2) и имеют нейронный маркер — Nestin [14]. Молочные зубы могут быть идеальным источником аутологичных СК, длительно сохраняются у детей.

СК периодонта зуба (PDLSC). B. Seo и соавт. [21] в 2004 г. впервые выделили PDLSC из периодонта третьего моляра. Периодонтальная связка относится к тканям пародонта и содержит гетерогенную популяцию клеток. PDLSC дифференцируются в остеобласты, хондробласты и липоциты.

Характеристика PDLSC зависит от локализации изолированных клеток, так как клетки, изолированные со стороны альвеолярной кости, демонстрируют бо́льшую способность к регенерации кости, чем клетки, изолированные с поверхности зуба [22]. PDLSC имеют фенотипы CD90⁺, CD29⁺, CD44⁺, CD166⁺, CD105⁺, CD13⁺, STRO-1⁺, CD146⁺, экспрессируют маркеры цементо- и остеобластов: щелочную фосфатазу, костный сиалопротеин, остеокальцин [8, 23]. В периодонте находятся остеобластоподобные клетки, способные к минерализации invitro и регенерации костной ткани.

Со-культивирование DPSC и PDLSC на PDLLA-матрице усиливает пролиферацию клеток обоих типов, дифференцировку в остеогенном направлении и степень экспрессии маркеров по сравнению с культивированием монокультуры.

Основная проблема использования PDLSC — сложность изолирования. Аутологичные PDLSC используют для регенерации цемента зуба, костной ткани, периодонтальной связки. В сочетании с матрицей HA/TCP способствуют образованию альвеолярной кости, цемента зуба и шарпеевских волокон при пародонтите, замещению дефекта нижней челюсти [24]. Использование аутологичных клеток не всегда рационально, в то время как при использовании аллогенных клеток необходимо избегать иммунного ответа.

СК фолликула зачатка зуба (DFSC). DFSC способны дифференцироваться в остеобласты и цементобласты, образующие очаги минерализации [11]. C. Morsczeck и соавт. [15] в 2005 г. выделили DFSC из зачатка третьего моляра и предположили, что эти клетки могут дифференцироваться в цементобласты, остеобласты и клетки периодонта. DFSC имеют рецепторы к остеокальцину и костному сиалопротеину, обладающие остеогенным потенциалом [15]. Они способны образовывать цемент, кость и периодонт, экспрессируют Notch-1, Nectin, Vimentin, маркеры ЭСК (TRA-1−60, TRA-1−81, Oct-4, CD133 и SSEA-4, Nanog, Rex-1) [11], могут воссоздавать поврежденный периодонт после имплантации. При формировании периодонта клетки дифференцируются в фибробласты, которые секретируют коллагеновый матрикс и волокна на поверхности прилежащей альвеолярной кости и цемента зуба.

Культивирование целого зуба. Одним из перспективных направлений регенеративной стоматологии является культивирование целого зуба. M. Oshima и соавт. [16] в 2011 г. культивировали СК зуба, которые позже пересадили мышам. Выращенные в ходе эксперимента однокорневые зубы по строению не отличались от нормальных, кроме расположения зубов относительно друг друга, небольших отклонений в геометрии апекса корня, положения бугорков, общего размера зуба.

Биоинженерный зуб получен при культивировании эпителиальных клеток тканей десны человека invitro и рекомбинации с MSC мыши. Он содержал эмаль с амелобластоподобными клетками, дентин и эпителиальные островки Малассе. J. Cai и соавт. [5] в 2013 г. дифференцировали integration-free human urine induced plurupotent stem cell в эмальсекретирующие амелобласты, которые затем рекомбинировали с мезенхимой зуба мыши и получили зубоподобные структуры. Рекомбинированный зуб обладал физическими свойствами обычного зуба.

В заключение отметим, что разные способности СК к дифференцировке, разнообразие носителей и факторов микроокружения определяют возможность использования этих клеток для регенерации тканей челюстно-лицевой области. Несомненно, имеющиеся в настоящее время данные позволяют использовать СК для регенерации как тканей зуба, пародонта, так и для замещения костных дефектов костей черепа и челюстей. Относительная доступность СК, высокие плотность популяции и способность к направленной дифференцировке значительно повышают их роль в замещении дефектов и открывают перспективы для развития регенеративной стоматологии.