Изучение свойств материалов, используемых для лечения гиперемии пульпы

Для сохранения жизнеспособности пульпы используют лечебные прокладки, нормализующие структуру и функцию пульпы при ее воспалении. Арсенал лекарственных препаратов для лечения воспаления пульпы широк и многообразен. Несмотря на это, остается актуальным поиск лечебных материалов, которые могут полноценно восстанавливать функции пульпы и одновременно увеличивать толщину надпульпарного дентина [1, 2, 5, 7].

Применение минерала минералтриоксиагрегата в целях лечения инициального пульпита изучается во многих работах. Биодентин - усовершенствованный минералтриоксиагрегат, который не разрушает клетки пульпы, стимулирует формирование третичного дентина, может использоваться как для защиты пульпы, так и в качестве временной пломбы [4, 9, 10, 11]. Определенный интерес представляет его отечественный аналог Рутдент, обладающий бактерицидными свойствами и стимулирующий образование вторичного дентина при лечении кариеса [3]. Из адгезивных систем хорошие результаты дает бондинговая система Футурабонд НР («Voco»). Данные многолетних клинических испытаний продемонстрировали ее чрезвычайно высокую силу сцепления, сопоставимую с таковой при использовании техники тотального травления [6, 8, 12]. Как бонд, не требующий предварительного травления, эта система экономит время и удобна для пациентов.

Цель нашего исследования - изучение антимикробной активности, генотоксических и цитотоксических свойств цементов Биодентин («Septodont»), Рутдент («TehnoDent») и адгезива Футурабонд НР («Voco») для научного обоснования выбора материала, обладающего наибольшей биосовместимостью с тканями пульпы.

Материал и методы

Исследование антимикробной активности проводили в условиях микробиологической лаборатории. Проведено 2 серии опытов. Исследованы водные вытяжки и образцы в виде изготовленных по специальному шаблону таблеток. Использовали контрольные штаммы микроорганизмов Escherichia coli, Staphilococcus aureus, Candida albiсans, Streptococcus faecalis. Учет результатов производили через 24 ч, измеряя зону задержки роста вокруг лунки (рис. 1, см. на цв. вклейке).

Рис. 1. Зоны задержки роста (мм) вокруг лунки при изучении антимикробной активности материалов.

Контролем служил водный раствор 0,05% раствора хлоргексидина.

Для оценки генотоксических свойств методом ДНК-комет в качестве тест-объекта использовали культуру фибробластов эмбриона человека. Тестирование исследуемых образцов проводили при 37 °С и 5% СО2 через 3 ч и 24 ч. Исследуемые образцы тестировали в 2 концентрациях: 2,0 и 5,0 мг/мл. В качестве позитивного контроля применяли фармакопейный пероксид водорода («Галено Фарм», Россия) в концентрации 0,3 ммоль. Для определения показателя поврежденности ДНК использовали процент ДНК в хвосте кометы (ТДНК). Статистический анализ проводили с применением критерия Стьюдента (р<0,05).

Цитотоксичность оценивали, применяя водные вытяжки из материалов и сами материалы. В эксперименте использовали фибробласты мыши линии NCTC L929, посевная концентрация клеток составляла 10 тыс./см². Вытяжки вносили через 1 ч после прикрепления клеток в разведениях 1/2, 1/10, 1/50, по 4 лунки на каждую дозу с последующим культивированием в среде ДМЕМ/F12 10% ЭТС при 37 °C в течение 1 сут. Для изучения адгезивных характеристик материалов и их способности поддерживать пролиферативную активность клеток использовали первичную культуру фибробластов (МЗ) мыши, полученных из кожно-мышечной ткани 13-дневных эмбрионов мышей линии C57BL/6-Tg(ACTbEGFP)1Osb/J, трансгенных мышей с геном-репортером, кодирующим синтез улучшенного зеленого флюоресцирующего белка (EGFP) под контролем промотора бета-актина цыпленка. В 1-е и на 5-е сутки инкубации проводили оценку морфологии клеток, культивируемых на поверхности исследуемых материалов, с использованием флюоресцентного микроскопа Axiovert 200.

Результаты и обсуждение

У вытяжки из цемента Биодентин нами было определено антимикробное действие по отношению к E. coli - зона задержки роста составила 17 мм (рис. 2)

Рис. 2. Определение антимикробной активности водных вытяжек из материалов.

, в контрольной группе (0,05% раствор хлоргексидина) - 34 мм. У образцов 1 (Футурабонд НР) и 3 (Рутдент) антимикробное действие не выявлено. В контрольной группе (0,05% раствор хлоргексидина) антимикробная активность определялась по отношению ко всем видам микроорганизмов: E. coli, S. aureus, C. albiсans, St. faecalis. Для подтверждения антимикробных свойств материалов Футурабонд НР и Рутдент проведена еще 1 серия опытов по вышеописанной методике. Из перечисленных материалов по специальному шаблону изготовлены образцы в виде таблеток диаметром 10 мм и толщиной 2 мм (рис. 3).

Рис. 3. Определение антимикробной активности материалов образцов-таблеток.

Все представленные для испытания образцы обладали антимикробной активностью (см. рис. 3). В отношении S. aureus наибольшая активность выявлена у цемента Рутдент (22 мм), наименьшая - у цемента Биодентин (18 мм) и адгезива Футурабонд НР (17 мм). У всех представленных материалов антимикробное действие было ниже, чем в контрольной группе (27 мм). Наибольшая активность по действию на E. сoli отмечена у адгезива Футурабонд НР (24 мм) и цемента Рутдент (22 мм), у материала Биодентин (15,5 мм) этот показатель несколько ниже по сравнению с 2 предыдущими материалами. Антимикробная активность по отношению к C. albicans была достаточно высокой у адгезива Футурабонд НР (24 мм). У цементов Биодентин (15,5 мм) и Рутдент (14 мм) показатели антимикробной активности сопоставимы и гораздо ниже показателя контроля (22 мм). При определении степени антимикробного действия на культуру St. faecalis отмечена высокая активность всех испытуемых образцов, особенно у цемента Рутдент (25 мм). У адгезива Футурабонд НР и цемента Биодентин результаты равнозначны (23 мм), эти показатели значительно превышали уровень активности в контрольной группе (0,05% раствор хлоргексидина) - 15 мм.

При изучении генотоксических свойств материалов вначале оценивали уровень спонтанных повреждений ДНК в одиночных клетках фибробластов эмбриона человека в норме (рис. 4, см. на цв. вклейке)

Рис. 4. Контроль; цифровое изображение с микропрепарата; фибробласты эмбриона человека. Здесь и на рис. 5-8: окрашивание ДНК этидиум бромидом 2 мкг/мл, ув. 300.

и при воздействии фармакопейного образца Н2О2 (рис. 5, см. на цв. вклейке)

Рис. 5. Позитивный контроль (Н2О2); цифровое изображение с микропрепарата; фибробласты эмбриона человека.

. Величина ДНК-повреждений в контрольной группе составила 0,92±0,16% ТДНК. Воздействие пероксида водорода в концентрации 0,3 ммоль приводило к повышению повреждения ДНК клеток (13,89±0,77% ТДНК). В норме индекс повреждений не должен превышать 2,5. При анализе результатов исследования статистически значимых различий между группами не выявлено (рис. 6-8, см. на цв. вклейке).

Рис. 6. Биодентин («Septodont»); цифровое изображение с микропрепарата; фибробласты эмбриона человека.

Рис. 7. Рутдент («TehnoDent»); цифровое изображение с микропрепарата; фибробласты эмбриона человека.

Рис. 8. Футурабонд («Voco»); цифровое изображение с микропрепарата; фибробласты эмбриона человека.

Все исследованные образцы не оказывали генотоксического воздействия на ДНК клеток независимо от концентрации и времени инкубации (рис. 9, 10).

Рис. 9. Генотоксичность исследуемых материалов на культуре клеток фибробластов эмбриона человека (инкубация - 3 ч).

Рис. 10. Генотоксичность исследуемых материалов на культуре клеток фибробластов эмбриона человека (инкубация - 24 ч).

При исследовании цитотоксичности оказалось, что при суточном выдерживании исследуемых материалов в культуральной среде ДМЕМ/F12 10% ЭТС происходит изменение кислотности среды: ее защелачивание материалами Рутдент и Биодентин и закисление материалом Футурабонд НР (рис. 11, см. на цв. вклейке).

Рис. 11. Изменение рН среды при приготовлении вытяжек из материалов. 1 - Рудент; 2 - Биодентин; 3 - Футурабонт.

По данным МТТ-теста, при разведении 1/2 вытяжки из материалов Рутдент, Биодентин и Футурабонд НР оказывают угнетающее воздействие на метаболическую активность клеток линии NCTC L929, наиболее выраженное у цемента Биодентин, наименее - у материала Рутдент. При разведении вытяжек 1/10 угнетающее воздействие такое же, как и при разведении 1/2, выявлено только у цемента Рутдент. У материалов Биодентин и Футурабонд HP при разведении 1/10 результаты равнозначны и незначительно ниже, чем в контроле. При разведении 1/50 лучшие результаты по цитотоксичности показал Биодентин, у всех материалов они сопоставимы с группой контроля (рис. 12).

Рис. 12. Жизнеспособность клеток NCTC L929 по данным МТТ-теста при разведениях вытяжек из материалов: 1 — 1/2; 2 — 1/10; 3 — 1/50.

При исследовании адгезии и ростовой активности эмбриональных фибробластов мыши на поверхности материалов выявлены отсутствие адгезии и роста клеток на образце Рутдент (рис. 13, см. на цв. вклейке)

Рисунок 13. Рис. 13а. Внешний вид первичных клеток МЗ, растущих на поверхности материала «Рудент». 1-е сутки инкубации.

Рисунок 13. Рис. 13б. Внешний вид первичных клеток МЗ, растущих на поверхности материала «Рудент». 5-е сутки инкубации.

, низкая степень распластывания при отсутствии роста клеток на поверхности материалов Биодентин и Футурабонд НР на 1-е и 5-е сутки инкубации (рис. 14, 15, см. на цв. вклейке).

Рисунок 14. Рис. 14а. Внешний вид первичных клеток МЗ, растущих на поверхности материала «Биодентин». 1-е сутки инкубации.

Рисунок 14. Рис. 14б. Внешний вид первичных клеток МЗ, растущих на поверхности материала «Биодентин». 5-е сутки инкубации.

Рисунок 15. Рис. 15а. Внешний вид первичных клеток МЗ, растущих на поверхности материала «Футурабонт». 1-е сутки инкубации.

Рисунок 15. Рис. 15б. Внешний вид первичных клеток МЗ, растущих на поверхности материала «Футурабонт». 5-е сутки инкубации.

Таким образом, цементы Биодентин («Septodont»), Рутдент («TehnoDent») и адгезив Футурабонд НР («Voco») обладают антимикробной активностью, не оказывают генотоксического действия, угнетающего воздействия на метаболическую активность при разведении в 50 раз. Наибольшей антимикробной активностью по отношению ко всем контрольным штаммам микроорганизмов обладал адгезив Футурабонд НР, наименьшей - цемент Биодентин. Все исследованные образцы не оказывали генотоксического воздействия на ДНК клеток. При оценке цитотоксичности материалов лучшие результаты показал цемент Биодентин, так как вызывал защелачивание среды, стимулируя одонтотропное действие, и не оказывал угнетающего воздействия на метаболическую активность клеток при меньшем разведении. Результаты проведенных лабораторных исследований позволяют использовать цементы Биодентин («Septodont»), Рутдент («TehnoDent») и адгезив Футурабонд НР («Voco») при лечении глубокого кариозного поражения дентина и начальных форм пульпита.