Выращивание зуба мыши методом гетеротопической трансплантации эмбрионального зачатка

Потеря зубов в результате различных заболеваний, плохой гигиены полости рта или травм приводит к нарушению речи и первичной обработки пищи, ухудшает эстетический вид, здоровье и качество жизни индивида в целом. По данным Второго национального эпидемиологического стоматологического исследования, в России у людей старше 65 лет в среднем удалено по 18 зубов, а 14% людей являются полностью беззубыми. Среди молодых людей до 30 лет также есть много тех, кто по разным причинам уже не имеет зубов. Для компенсации утраченного зуба используют искусственные коронки или имплантаты. Однако они не имеют иммунных клеток, нервных окончаний и кровеносных сосудов, цемента и перио-донтальных связок и поэтому не реагируют на инфекцию, не имеют чувствительности, не регенерируют дентин и не имеют амортизирующей подложки, как натуральные зубы. Искусственные заменители зубов имеют ограниченный срок эксплуатации и могут провоцировать развитие различных осложнений.

Новую стратегию восстановления утраченных зубов предлагает регенеративная стоматология, а именно размещать на место утраченного зуба натуральный зуб, выращенный по законам естественного одонтогенеза или созданный с помощью методов тканевой инженерии [1]. Современные исследования направлены главным образом на выращивание зуба из биоинженерного зачатка, собранного из дентальных эпителиальных и мезенхимальных клеток [2—4]. Однако при сборке биоинженерного зачатка невозможно воспроизвести сложные эпителиально-мезенхимальные взаимосвязи и все особенности натурального зачатка (тем более, что многие из них до сих пор не изучены и не известны), такие как точная компартментализация клеток, количественные соотношения разных пулов клеток и степень их дифференцированности, состав и расположение базальной мембраны, состав и архитектура экстраклеточного мат-рикса и т. д. Поэтому выращенные биоинженерные зубы можно было охарактеризовать лишь как зубоподобные образования с нарушениями минерализации, формы, цвета и структуры дентина и эмали.

Цель настоящей работы — выращивание зуба из натурального зачатка с ненарушенными структурой и эпителиально-мезенхимальными функциональными связями.

Исследования выполнены на мышах С57BI/6J (Филиал «Андреевка» ФГБУН НЦБМТ ФМБА России) весом 25—30 г (n=7). Во время экспериментов мыши содержались в индивидуальных клетках в виварии в стандартных условиях.

Выделение эмбрионального зачатка зуба мыши проводили по методике Tsuji [5]. Эмбрионы извлекали на эмбриональный день (ЭД) 14.5 сразу после декапитации мыши и помещали в охлажденный (4 °С) физиологический раствор. Нижнюю челюсть изолировали и разрезали пополам (рис. 1).

Гетеротопическую трансплантацию зачатка зуба и кусочка эмбриональной челюсти проводили под почечную капсулу. Для этого анестезированную хлор-алгидратом (200 мг/кг, в/б) мышь фиксировали за конечности на операционном столике. Затем делали разрез кожи длиной около 2 см и при помощи пинцета отделяли кожу от мышечного слоя, разрезали мышечный слой и доставали почку. После этого скальпелем делали надрез почечной капсулы длиной 2—3 мм, при помощи пинцета отделяли небольшой участок капсулы от паренхимы почки и помещали заранее подготовленный зачаток зуба или кусочек эмбриональной челюсти в пространство между капсулой и паренхимой почки. Затем аккуратно возвращали почку в брюшную полость и зашивали разрез послойно.

Через 2 нед животных умерщвляли методом декапитации, структуры, выросшие из зачатка зуба и кусочка эмбриональной челюсти, выделяли, оценивали визуально и помещали в забуференный 10% формалин для последующего гистологического исследования (рис. 2).

На рис. 1 представлены выделенная нижняя челюсть эмбриона мыши (а) и зачаток зуба (б) под микроскопом на ЭД 14.5. Морфологическая структура зачатка соответствовала стадии «колпачка» естественного одонтогенеза [6].

Через 2 нед после гетеротопической трансплантации эмбрионального зачатка зуба под почечную капсулу из мест трансплантации были выделены сформированные маленькие зубы (рис. 2).

Гистологическая картина поперечного разреза выращенного зуба представлена на рис. 3, а.

Обращает на себя внимание четкая асимметрия в отложении эмали по окружности зуба: с одной стороны зуба эмаль формирует толстый слой (см. рис. 3, а), а с противоположной — эмаль практически отсутствует. Хорошо известно, что такое асимметричное расположение эмали характерно для резцов грызунов. Эта особенность необходима для формирования режущего края резца. Таким образом, можно утверждать, что выросший под капсулой почки зуб представляет собой резец.

Через 2 нед после гетеротопической трансплантации эмбрионального кусочка челюсти из мест трансплантации были также выделены хряще/костноподобные структуры. Они были значительно менее твердыми, чем выращенные зубы. Гистологическая картина этих выращенных образований представлена на рис. 3, б. На гистологическом препарате видна мезенхима с формирующимися костными трабекулами с остеобластами и хрящевой тканью. На этом препарате не обнаружился ни один из специфических видов зубных клеток или ткани. Наиболее вероятно, что эта гистологическая структура представляет собой растущую после гетеротопической трансплантации альвеолярную кость.

К настоящему времени накопилось большое количество данных о том, что стволовые клетки после гетеротопической трансплантации под действием другого микроокружения могут менять свой фенотип. Так, G. Ferrari и соавт. показали, что костный мозг взрослой мыши содержит стволовые клетки, которые в специфическом микроокружении могут приобретать фенотип мышечных клеток [7]. Было также показано, что стволовые клетки, которые могут дифференцироваться в нейроны, под действием микро-окружения молочных желез утрачивают нейрональную идентичность [8]. Наконец, Y. Barrandon и соавт. [9] продемонстрировали, что эпителиальные клетки взрослого и эмбрионального тимуса мыши после гетеротопической трансплантации в кожу приобретают фенотип мультипотентных стволовых клеток луковицы волоса, а при обратной трансплантации в тимус восстанавливают свой фенотип. Способность клеток менять свой фенотип под действием микро-окружения была определена как пластичность [10].

Сигналы, генерируемые в микроокружении взаимодействием клеток между собой и с экстраклеточным матриксом, действием растворимых молекул, физическими и химическими факторами, определяют судьбу стволовой клетки — останется ли она в состоянии покоя, начнет делиться симметрично или асимметрично, продуцируя одну стволовую клетку, а другую дифференцированную. Изучение механизмов действия этих сигналов привело к рождению концепции ниши стволовых клеток [11]. Под нишей стволовых клеток понимают микросреду, в которой находятся эти клетки и из которой они получают сигналы, определяющие их фенотип [12].

В нашей работе продемонстрирован интересный факт, что, несмотря на серьезное изменение микро-окружения зачатка зуба под капсулой почки, из стволовых клеток зачатка зуба все же вырос зуб. Почечное микроокружение взрослой мыши никак не нарушило генетическую программу одонтогенеза, которая в естественных условиях развивается в дентальном микроокружении эмбриона. Этот факт демонстрирует высокую пенетрантность механизмов одонтогенеза. Работа A. Lechguer и соавт. [13] позволит сделать такой же вывод. Эти иследователи показали, что клетки эмбриональных зачатков моляров мыши через 2 нед после трансплантации под кожу, так же как и в наших экспериментах после трансплантации под капсулу почки, сформировали зуб. Это, казалось бы, противоречит понятию пластичности и концепции ниши стволовых клеток. Почему стволовые клетки эмбрионального зачатка зуба, несмотря на пересадку в другое микроокружение, под капсулу почки или кожу, все равно дифференцируются в одонтогенном направлении и продуцируют зуб?

Устранить противоречие и «примерить» наши данные и данные A. Lechguer и соавт. [13] с представлениями о пластичности стволовых клеток и концепцией ниши стволовых клеток можно, если допустить, что при переносе зачатка зуба в другое, «не одонтогенное» микроокружение вместе со стволовыми клетками зачатка переносится и их «одонтогенная» ниша, сформированная матриксом зачатка зуба. Тогда становится понятным, почему, несмотря на смену тканевого окружения с ротового на почечное или подкожное, все равно из дентальных стволовых клеток зачатка формируется зуб. В этом случае ткань-реципиент (почка или кожа) выполняет важные, но не специфические для дифференцировки стволовых клеток функции, а именно поддержание нормальной температуры и — благодаря кровотоку — снабжение зачатка кислородом и питательными веществами.

Во всем мире выращивание зуба мыши не является самоцелью. Главная цель — научиться выращивать человеческие зубы. Для этого необходимо ответить на несколько очень сложных вопросов:

1. Какой исходный биоматериал выбрать для выращивания зуба человека? В эксперименте на мышах использование эмбриональных клеток зачатка зуба позволяет вырастить зуб. Однако для выращивания человеческого зуба невозможно получить аутологичный эмбриональный зачаток зуба, а использование аллогенных эмбриональных зачатков или стволовых клеток ограничено законодательными, этическими, религиозными и моральными причинами, а также риском образования опухоли [14]. Поэтому исследователи попробовали использовать аутологичные взрослые стволовые и индуцированные плюрипотентные клетки для создания биоинженерных зубов [15, 16]. Однако пока полученные биоинженерные зубы не воспроизводят всю совокупность свойств натурального зуба.

2. Как обеспечить кровоснабжение и иннервацию пересаженного в челюсть выращенного зуба? Снабжение кровью и иннервация необходимы для функцио-нирования зуба. Поэтому важно, чтобы новый зуб стимулировал реваскуляризацию и реиннервацию. Вероятно, эту проблему можно решить добавлением факторов роста сосудов и нервов.

3. Как обеспечить приемлемый срок выращивания зуба? Если воспроизводить естественный одонтогенез, выращивание зуба человека потребует нескольких лет. Такие зубы не смогут конкурировать с искусственными имплантатами. Проблему можно было бы решить, если разработать способ ускоренного роста зубов человека.

4. Как при пересадке выращенного зуба учитывать фактор времени? Будет ли новый зуб расти в соответствии с ростом окружающих тканей, и как со временем изменятся свойства пересаженного зуба? Есть данные, что через 20—30 лет пересаженная ткань может инициировать рост опухоли.

Не вызывает сомнения, что в следующем десятилетии регенеративная стоматология станет неотъемлемым компонентом лечения многих заболеваний зубов. Есть основания полагать, что технологии выращивания зубов в значительной степени заменят существующие методы протезирования зубов. Важно и то, что разработанные технологии выращивания зуба могут помочь развитию технологий регенерации других органов и окажут влияние на всю регенеративную медицину.

Благодарности. Авторы благодарны М.А. Морозовой за техническую помощь в оформлении статьи. Обзор написан при поддержке Министерства здравоохранения РФ (Государственное задание Министерства здравоохранения РФ от 2 февраля 2016 г. № 056−00139−16, уникальный номер реестровой записи: 110 401 000 000 000 000 071 021 02).

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

*e-mail: iymalyshev1@gmail.com