Взаимодействие фибробластов с имплантологическими и протетическими материалами

В практике дентальной имплантологии нередко выявляются мукозит и периимплантит как следствие недостаточной гигиены в области имплантатов и их перегрузки [1—9]. Однако нельзя исключить скрытых механизмов аллергического и токсико-химического воздействия на периимплантатные ткани в связи с индивидуальной реактивностью организма. Не случайно разработчики систем имплантатов совершенствуют технологии обработки поверхности имплантатов и продолжают поиск наиболее биохимически и биомеханически совместимых с костной тканью материалов. Сказанное в полной мере относится и к конструкционным материалам зубных протезов, опирающихся на имплантаты, и контактирующих с периимплантатной десной.

Цель исследования — изучение реакции клеточной культуры фибробластов на современные имплантологические и протетические материалы.

Материал и методы. Из Коллекции культур тканей НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского были выбраны нормальные клетки фибробластов эмбриона человека (ФЭЧ-Т). Для культивирования использовали среду Игла (производства Института полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова).

Для изучения биосовместимости и влияния на ростовую активность клеток ФЭЧ-Т стоматологических материалов применяли метод МТТ [10]. МТТ-колориметрический тест служит биологическим стандартом и рекомендован в этом качестве для оценки цитотоксического действия различных чужеродных веществ на клетки. Тест основан на прямой коррекции количества жизнеспособных клеток и интенсивности метаболизма специального реактива МТТ до водорастворимого темноокрашенного формазана под действием митохондриальной сукцинатдегидрогеназы (мертвые клетки и клетки со сниженной жизнеспособностью такой способностью не обладают). Последующая фотометрия растворенного с помощью диметилсульфоксида (ДМСО) формазана позволяет точно сопоставить изменение оптической плотности раствора по отношению к контролю с изменением количества жизнеспособных клеток, а в цитотоксических исследованиях оценить специфическую гибель клеток, индуцированную тем или иным цитотоксическим агентом. Предварительно отмытые и автоклавированные образцы исследуемых материалов укладывались в лунки 24-луночного планшета. Суспензия клеток в посевной дозе 13∙10⁵ кл/мл в среде Игла с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (Россия) вносилась в каждую лунку планшета. Планшеты с образцами и клетками инкубировались в термостате СО2 при 37 °C в течение 48 ч. После инкубации культуральную среду удаляли и проводили МТТ-реакцию. После инкубации клеток культуральную среду отсасывали из лунок, добавляли по 1 мл среды с 200 мкл МТТ (3[4,5-диметил-тиазол-2-ил]-2,5-дифенилтетразолия, «Sigma») в исходной концентрации 5 мг/мл и инкубировали в течение 4 ч. Затем среду с МТТ удаляли и добавляли по 1 мл ДМСО для растворения образовавшихся кристаллов формазана. Осадок клеток ресуспендировали в течение 5 мин пипетированием. Жизнеспособность клеток оценивали по интенсивности окраски раствора, измеряя оптическую плотность при длине волны 545 нм фотометра Immunochem 2100 (США).

Подсчет выросших клеток, их размера и объема в виде гистограммы производился с помощью ручного автоматизированного счетчика клеток — пипетки Scepter Millipore (Германия), которая позволяет получить данные о популяции клеток, концентрации, распределению по размеру и объему. Инкубация фибробластов производилась в течение 96 ч. Затем монослой выросших на дне лунок клеток изучался визуально в световом микроскопе Olympus СКХ41 (Япония), снимался смесью 0,02% Версен-Химопсин и разводился в 1 мл среды Игла для подсчета пипеткой Scepter Millipore.

Для изучения морфологии клеток, характера их прикрепления к субстрату использовали окрашивание акридином оранжевым. Взаимодействуя с чистыми нуклеиновыми кислотами, акридиновый оранжевый образует комплексы, флюоресцирующие зеленым при связывании с ДНК и красным при связывании с РНК. После инкубации в течение 96 ч удаляли культуральную среду, лунки промывали дважды 1 мл PBS (фосфатным буфером) и добавляли по 1 мл 95% спирта. Через 15 мин удаляли спирт и высушивали лунки. Затем добавляли по 1 мл 0,01% акридиновый оранжевый на 10 мин, отмывали дважды 1 мл PBS. Покровные стекла с окрашенными клетками вынимались и изучались в флюоресцентном микроскопе Opton Axioskop (ФРГ).

Исследовались следующие материалы известных фирм производителей: титан Grade 4; титан-ниобий-циркониевый сплав; титан-ниобий-танталовый сплав; никелид титана; хромокобальтовый сплав; диоксид циркония для каркасов несъемных протезов; диоксид циркония для дентальных имплантатов; прессованная керамика; материал для съемных протезов на основе полиметилметакрилата; материал для съемных протезов на основе нейлона.

Результаты. Исходя из полученных данных в опытах на биосовместимость, влияние на ростовую активность ФЭЧ-Т с помощью МТТ метода все образцы (за исключением композита светового отверждения) через 24 ч инкубации не оказывали токсического влияния на клетки, поскольку показатели не выходили за пределы 20,0% разницы с показателями контрольного образца. Однако обращает внимание заметная разница с контролем у материала для съемных протезов на основе полиметилметакрилата (18,1%).

При изучении морфологии клеток после 96 ч инкубации большинство материалов не угнетали ростовую активность клеток, а сами фибробласты не отличались от контроля. В то же время выявлен процесс дегенерации клеток ФЭЧ, что выражалось в округлении клеток, их укорачивании и откреплении от пластика на дне лунки, в присутствии хромокобальтового сплава, материала для съемных протезов на основе полиметилметакрилата. Так, концентрация клеток в присутствии указанных материалов составляла в сравнении с контрольной соответственно 62,2 и72,0%.

После окрашивания клеточной культуры акридиновым оранжевым клетки контроля флюоресцировали в ультрафиолетовом свете желтым цветом, максимально при 550 нм, ядро клеток испускало яркую флюоресценцию, и цитоплазма тоже излучала свечение. Инкубация клеточной культуры в присутствии хромокобальтового сплава, материала для съемных протезов на основе полиметилметакрилата испускала флюоресцентный свет меньшей интенсивности.

Вывод. Клеточная культура фибробластов человека позволяет дифференцировать имплантологические и протетические материалы по биосовместимости. Выявлено определенное негативное воздействие на фибробласты человека таких материалов, как хромокобальтовый сплав и материал для съемных протезов на основе полиметилметакрилата. Также подтверждена высокая биосовместимость имплантатов из разных сплавов титана и керамики.