Значительная распространенность заболеваний пародонта среди населения, устойчивость к проводимой терапии и резкое снижение качества жизни пародонтологических пациентов требует более совершенного и эффективного подхода к диагностике, лечению и профилактики данной патологии [1]. По данным ВОЗ, основанным на статистике 53 стран мира, в различных возрастных группах заболеваемость гингивитом и пародонтитом достигает 80—100% и является основной причиной потери зубов у лиц старше 40 лет [2]. К настоящему времени не вызывает сомнений, что в развитии заболеваний маргинального пародонта важнейшую роль играют воспалительные реакции, спровоцированные микроорганизмами ротовой полости [3]. Однако на смену концепции планктонных форм микробного возбудителя заболеваний пародонта пришли теории ассоциации микробных сообществ — биопленок. Многие аспекты функционирования данной многоуровневой системы до сих пор остаются не изученными. Не полностью определены также факторы, способствующие разрушению биопленок.
Цель исследования — определить спектр микроорганизмов пародонтального кармана, способных образовывать микробные сообщества, изучить способность химических и биологических объектов разрушать матрикс микробной биопленки in vitro.
Материал и методы. С целью изучения пародонтальной микрофлоры нами были обследованы 77 пациентов с хроническим пародонтитом. В день обращения перед проведением лечебных мероприятий (проба 1) и в день завершения лечения (проба 2) производился забор ротовой жидкости за час до еды в стерильные пробирки. Идентификацию микроорганизмов проводили с помощью тест-систем на автоматизированном биохимическом анализаторе ATB EXPRESSION. Статистическая обработка полученных результатов проводилась с использованием программ Statistica 10.0, MS Excel.
Результаты. Микробиологические исследования содержимого пародонтальных карманов позволили выделить и идентифицировать 13 видов микроорганизмов, из них 25% составил Streptococcus oralis, 7,5% — S. mitis, 5% — S. mutans, 12,5% — S. sanquinis, Staphylococcus spp, Lactobacillus spp, 10% — Candida spp, 5% — Gemella heamolysans, G. morbillorum, Pseudomonas aeruginosa, 2,5% — Enterococcus faecalis, Leuconostoc spp, Lc lactis lactis.
Для определения способности полученного штамма к образованию биопленки был использован метод с применением 96-луночного пластикового планшета [4]. Для вычислений использовалась формула (multiplicative модель):
Y= 25,75·0,2·Еоп1,275/26,0
Масса биопленки 10 штаммов S. oralis, выделенных от разных пациентов, была в пределах 0,012—0,030 мкг на лунку, 3 штаммов S. mitis составила от 0,0005 до 0,009 мкг на лунку, 2 штаммов S. mutans — от 0,0087 до 0,01 мкг на лунку, из выделенных 2 штаммов S. sanquinis способностью к образованию биопленки обладал только один, масса биопленки которого составила 0,004 мкг на лунку. После анализа полученных данных нами для получения биопленки был выбран штамм с наиболее высокой способностью ее продуцирования.
Масса биопленки 10 штаммов S. oralis, выделенных от разных пациентов, была в пределах 0,012—0,030 мкг на лунку, 3 штаммов S. mitis составила 0,0005—0,009 мкг на лунку, 2 штаммов S. mutans — 0,0087—0,01 мкг на лунку, из выделенных 2 штаммов S. sanquinis способностью к образованию биопленки обладал только один, масса которого составила 0,004 мкг на лунку. После анализа полученных данных нами для получения биопленки был выбран штамм с наиболее высокой способностью ее продуцирования.
Для оценки способности химиопрепаратов и ротовой жидкости расщеплять экзополимерный матрикс биопленки применяли разработанный нами метод [5].
Из ферментов наибольшая активность наблюдалась у гиалуронидазы I типа (бычья) 0,2±0,004 мг. Более низкие показатели способности разрушать экзополимерный матрикс биопленки обнаружены нами у ферментов: альфа-амилаза (porcine pancreas) — 0,001±0,0005 мг, альфа-ДНКаза (human) — 0,009±0,0009 мг, гиалуронидаза III (streptococcus) — 0,008±0,0004 мг, лизоцим (human) — 0,0012±0,0009 мг, пепсин (human) — 0,0073±0,001 мг, пероксидаза (horseradish) — 0,008±0,001 мг, протеиназа К (tritrachium album) — 0,092±0,009 мг, рибонуклеаза (bovine pancreas) — 0,0017±0,0002 мг, трипсин (bovine pancreas) — 0,00003±0,00001 мг. Папаин (Carica papaya) подобной активностью не обладал. При анализе сочетанного действия ферментов (гиалуронидаза I (бычья), альфа-ДНКаза, протеиназа К) на экзополимерный матрикс биопленки S. oralis установлено, что происходит взаимное ингибирование активности.
Наиболее активным антисептиком на основании опытных данных является диметилсульфоксид 25%, его показатель способности разрушать экзополимерный матрикс биопленки составил 1,33±0,03 мг. В меньшей степени оказались эффективны перекись водорода 3% (0,0024±0,0002 мг), цетилпиридиния хлорид (0,0037±0,00006 мг), хлоргекседин биглюконат 2% (0,0005±0,00005 мг). У антисептиков: септомирин (мирамистин), стоматидин (гексетидин), хлоргекседин биглюконат 0,05%, «Белодез» (гипохлорит натрия 3%), фурациллин и йодиксин — не было выявлено способности разрушать биопленку. Также была исследована способность аскорбиновой кислоты и ацетилцистеина разрушать матрикс биопленки, активность которых составила 0,0018±0,00007 и 0,002±0,0003 мг соответственно.
Для определения времени экспозиции и концентрации было изучено действие ферментов и антисептиков на протяжении 24 ч. На основании анализа графиков было установлено, что альфа-ДНКаза и гиалуронидаза I (бычья) обладают максимальной активность при экспозиции 20 с в концентрации 1,5 и 0,75 мг/мл соответственно, в то же время активность диметилсульфоксида наибольшая в концентрации 25% и проявляется в первые секунды взаимодействия.
Вывод. Разработаны и апробированы методы: формирования биопленки S.oralis в лунках полистиролового 96-луночкого планшета для ИФА, индикации биопленки спектрофотометрически, а также способы количественной оценки биомассы микробной биопленки S. oralis in vitro, позволяющие стандартизировать формирование и изучение микробных сообществ. С помощью предложенной экспериментальной модели для определения действия химических объектов на микробные сообщества обнаружено, что среди антисептиков, широко распространенных в клинической практике, наиболее эффективен в отношении биопленки, образованной S. oralis, диметилсульфоксид 25%, активность которого проявляется в первые секунды взаимодействия, при этом его показатель способности разрушать экзополимерный матрикс биопленки составил 1,33±0,03 мг. С помощью предложенной экспериментальной модели биопленки S. oralis меченым Конго красным обнаружено, что среди исследованных ферментов наибольшая активность наблюдалась у гиалуронидазы I типа (bovine testis) — 0,2±0,004 мг, что, вероятно, связано с расщеплением гиалуроновой кислоты матрикса, оптимальное время экспозиции 20 с в концентрации 0,75 мг/мл.