Проблема восстановления костной ткани является актуальной задачей в современной хирургической стоматологии и челюстно-лицевой хирургии, о чем свидетельствуют непрекращающиеся поиски новых и совершенствование известных остеопластических материалов для восстановления дефектов костной ткани.
Наиболее перспективным направлением повышения остеоиндуктивности костных имплантатов и усиления регенерации костной ткани является создание биокомпозитных материалов, содержащих основные компоненты ткани (трикальцийфосфат, гидроксиапатит, костные белки).
В 1965 г. Urist сделал основополагающее открытие, доказав, что деминерализованный костный матрикс способен вызывать образование новой кости вследствие биохимической активизации костных белков. Описанные Urist как «особые остеоиндуктивные белки», позже определенные как «костные морфогенетические белки», или «bone morphogenetic protein» (BMP), в течение 40 лет были предметом активного изучения фундаментальной науки, экспериментов на животных и клинических апробаций. Согласно результатам современных исследователей костные морфогенетические белки являются самыми важными факторами регенерации кости и хряща. Опыты на животных и широкое клиническое применение продемонстрировали эффективность BMP в качестве активного стимулятора остеогенеза, по своему регенераторному потенциалу равного или превосходящего аутологичный костный материал.
Современные биомедицинские технологии предусматривают использование данных остеиндукторов в виде рекомбинантных белков (rhBMP), фиксированных на носителях, которые могут быть: синтетические, биологические, минеральные или биокомпозитные полимеры.
Несмотря на все преимущества аутологичной кости в качестве костного трансплантата (наличие клеточных элементов костного мозга, факторов роста и локального кровоснабжения), по единодушному мнению ведущих зарубежных хирургов, рекомбинантные костные морфогенетические белки (rhBMP-2), фиксированные на биологическом носителе, являются реальной альтернативой аутологичному костному материалу.
Цель. Основываясь на вышеизложенном и учитывая проблему доступности использования зарубежных аналогов, мы поставили перед собой следующие задачи: 1) изучить целесообразность использования свода черепа крысы как модели критического дефекта костной ткани; 2) установить сроки образования новой костной ткани в зоне дефекта под действием морфогенетического белка кости и оценить ее гистоморфологический состав; 3) оценить влияние морфогенетического белка кости в составе остеопластического материала на минеральную плотность новообразованной костной ткани, а также на ткань, окружающую дефект.
Материал и методы. Для решения этих задач нами был запланирован и впервые проведен эксперимент на крысах с формированием критического дефекта диаметром 8 мм в своде черепа и заполнения его деминерализованным костным матриксом, насыщенным отечественным морфогенетическим белком кости с последующими гистоморфометрическим, гистоморфологическим, рентгенологическим исследованиями новообразованной костной ткани и анализом полученных результатов для разработки практических рекомендаций к его применению. В исследовании использовали биокомпозиционный материал на основе деминерализованного костного матрикса в виде крошки в чистом виде и соединенный с рекомбинантным морфогенетическим белком кости (rhBMP-2). Синтез и соединение рекомбинантного морфогенетического белка с деминерализованным костным матриксом проводились на базе Института теоретической и экспериментальной биофизики Российской академии наук (ИТЭБ РАН) по методике, описанной зарубежными авторами. Концентрация белка в имплантате составляла 0,6—0,8 мг/см3. В эксперименте использовано 18 половозрелых самцов белых крыс массой тела 400—500 г. Во всех случаях выполнялась операция по одной и той же методике.
Техника операции. Все операции выполнялись под общим наркозом Золетил 100 0,2 мл. В центре свода черепа при помощи трепана выполнялся сквозной костный дефект диаметром 8 мм. Образованный дефект заполнялся различными костнопластическими материалами, заготовленными заранее (ортотопичесчкая имплантация). Рана ушивалась узловыми швами наглухо. Из эксперимента животных выводили путем передозировки наркоза. Животные были разделены на три группы, 1-я группа — контрольная, 2-я и 3-я группы — экспериментальные (по 6 крыс в каждой). У животных 2-й группы (группы сравнения) дефект заполняли чистым деминерализованным костным матриксом, а у животных 3-й (основной) группы дефект заполняли деминерализованным костным матриксом, содержащим rhBMP-2. В контрольной группе дефект заживал под сгустком. Из эксперимента животные выводились в следующие сроки: один, два и три месяца, по две крысы из каждой группы. После выведения всех животных из эксперимента проводили рентгеновское исследование черепа крысы. Следующим этапом выполняли сегментарную остеотомию свода черепа, после чего сегмент свода черепа фиксировали в формалине и помещали в пробирку для морфологического исследования, которое проводили в течение первых десяти дней после выведения животных из эксперимента.
Гистологическая проводка. Гистологическое исследование образцов ткани проводили непосредственно после биопсии. Материал помещали в 10% раствор формалина на фосфатном буфере на 72 ч, после чего в течение 24 ч образцы ткани промывали в проточной воде. Серийные резы получали на микротоме Microm (7 мкм). Для изучения срезов тканей использовали следующие методы: обзорные окраски — гематоксилином и эозином по Майеру; для выявления специфических процессов образования костной ткани и резорбции ее препараты окрашивали по Массону-Голднеру (BioOptica, Italy).
Документирование. Фотодокументирование проводилось на микроскопе Leica DM2500 с фотокамерой Leica DTC295. В качестве метода рандомизации использовалась следующая схема, если не было необходимости в прицельном изучении объекта, то с помощью генератора случайных чисел Random определялись 5—7 номеров, которые подвергались изучению и документированию.
Морфометрия. Для определения основных процессов образования, резорбции, созревания костной ткани в костных регенератах мы использовали гистоморфометрическую платформу, рекомендованную Международной ассоциацией исследователей костной ткани. При морфометрическом исследовании определяли объемную долю (%) костной ткани BV, фиброзной ткани FbV, материала MatV, и ретикулофиброзной ткани RetV.
Результаты. 1-я группа. 30 дней. При гистологическом исследовании костных регенератов в контрольной группе обращало на себя внимание, что фронт регенерации костной ткани с обоих полюсов распространялся к центру по твердой мозговой оболочке. Морфометрическое исследование выявило следующее распределение основных структурных компонентов в регенерате: BV — 32,27%, RevV — 69,35%, FbV — 0,00, MatV — 0,00.
1-я группа. 60 дней. При исследовании образцов через 60 дней после операции в контрольной группе обращало на себя внимание, что костный регенерат распространяется с материнского ложа вплоть до центра дефекта, однако заполнение его полностью не происходит, а он в свою очередь имеет ячеистую структуру. BV — 62,44%, RevV — 27,56%, FbV — 0,00, MatV — 0,00.
1-я группа. 90 дней. При гистологическом исследовании образцов из данной группы обнаружено, что сформированные в центре регенерата костные балки имеют зрелый характер, однако ячеистая структура регенерата сохранена. BV — 76,18%, RevV% — 19,87%, FbV — 0,00, MatV — 0,00.
2-я группа. 30 дней. Через 30 сут после имплантации остеопластического материала без рекомбинантного костного морфогенетического белка (rhBMP-2) при гистологическом исследовании образцов выявлено, что с краев материнской кости фронт костной регенерации распространяется к центру не симметрично, больше с одного из полюсов. При морфометрическом исследовании определены следующие показатели структурной организации костного регенерата: BV — 21,26%, RevV — 11,71%, FbV — 22,90%, MatV — 29,35%.
2-я группа. 60 дней. При гистологическом исследовании образцов из данной группы обращало на себя внимание, что аппозиционный рост костного регенерата не имеет значительного продолжения. BV — 16,0%, RevV — 0,00%, FbV — 47,0%, MatV — 37,5%.
2-я группа. 90 дней. При исследовании образцов теменных костей крыс через 90 дней после имплантации остеопластического материала обнаруживается, что костный регенерат у краев дефекта имеет зрелый характер. BV — 30,15%, RevV — 0,00%, FbV — 47,76%, MatV — 30,15%.
3-я группа. 30 дней. В образцах данной группы обращало на себя внимание, что костный регенерат с материнской кости имел тенденцию к росту в направлении центра. Однако максимальный и наиболее выраженный рост отмечался с одного из полюсов. При морфометрическом исследовании определены следующие показатели структурной организации костного регенерата: BV — 25,41%, RevV — 11,71%, FbV — 22,90%, MatV — 29,35%.
3-я группа. 60 дней. Гистологическая картина в образцах через 60 дней после имплантации остеоиндуктивного материала, содержащего костный морфогенетический белок, характеризовалась замедлением процессов неоостеогенеза, созреванием новообразованной костной ткани. BV — 34,35%, RevV — 0,00%, FbV — 33,61%, MatV — 30,27%.
3-я группа. 90 дней. При исследовании образцов теменных костей черепов крыс на сроке 90 суток обнаруживается, что костный регенерат у краев дефекта имеет зрелый характер. BV — 22,20%, RevV — 2,93%, FbV — 55,31%, MatV — 30,15%.
Вывод. В результате проведенного исследования установлено, что использованная модель критического дефекта костной ткани является адекватной и отвечает требованиям к поставленным целям и задачам; имплантация материала с BMP-2 показывает разницу с группой сравнения в первые 2 срока наблюдения (1 и 2 мес) в сторону более высокой эффективности образования костной ткани по сравнению с имплантацией материала, не содержащего BMP-2; имплантация костного остеопластического материала препятствует регенерации, ограничивая его распространение к центру, за счет существования хронического продуктивного воспаления (реакции на инородное тело).